Cyr61的表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力影響的研究

鄭慧敏，李連興

（赤峰市醫(yī)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

胃癌是全球常見(jiàn)的惡性腫瘤，中國(guó)胃癌發(fā)病例數(shù)占全球胃癌發(fā)病的42.6%、死亡例數(shù)占全球死亡的45%，位于全球發(fā)病率的第5位，死亡率的第6位[1]。目前，惡性腫瘤的靶向治療被認(rèn)為是未來(lái)惡性腫瘤治療中最具前景的方向，然而靶向治療的前提和關(guān)鍵是有合適的靶點(diǎn)[2]。因此，對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和血管形成機(jī)制的研究可以為尋找到預(yù)防和治療胃癌的靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)，對(duì)降低胃癌患者死亡率、延長(zhǎng)患者壽命都具有十分重要的意義。

高半胱氨酸蛋白61(cysteine rich 61，Cyr61)是生長(zhǎng)因子CCN家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員。越來(lái)越多的證據(jù)表明腫瘤組織中Cyr61表現(xiàn)出不同程度的異常。一方面是過(guò)度表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)Cyr61在胃癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、膀胱癌、前列腺癌等多種腫瘤中呈高表達(dá)[3,4]。有趣的是在非小細(xì)胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌、黑色素瘤、前列腺癌中Cyr61呈低表達(dá)狀態(tài)[5,6]。因此，本研究繼續(xù)探究Cyr61對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及分子機(jī)制，為Cyr61能否真正成為預(yù)防和治療胃癌的新靶點(diǎn)提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑細(xì)胞MGC80-3細(xì)胞系獲自中科院。RPMI-1640，DMEM培 養(yǎng) 液 購(gòu) 自Corning公 司。RIPA蛋白裂解液購(gòu)自碧云天公司。蛋白Marker和ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒購(gòu)自Thermo公司。Transwell小室購(gòu)自Corning公司，MTT檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，pEGFP-H1/Cyr61病毒購(gòu)于吉?jiǎng)P基因公司。針對(duì)蛋白質(zhì)的抗體：Cyr61兔抗體（Abcam，美國(guó)，編號(hào)ab233097，按1:1000稀釋?zhuān)APDH小鼠抗體（Santa cruz，美國(guó)，sc-32233，按1:2000稀釋?zhuān)５蛲鲈噭┖匈?gòu)自eBioscience公 司。DPBS，Matrigel購(gòu)自Corning公 司。Calcein-AM購(gòu)自Thermo公司。

1.2構(gòu)建表達(dá)沉默Cyr61的短發(fā)夾RNA（shorthairpin RNA,shRNA）的真核質(zhì)粒表達(dá)載體pEGFP-H1/Cyr61設(shè)計(jì)RNAi沉默Cyr61表達(dá)在Cyr61 mRNA序列上的靶位點(diǎn)，選擇3-5個(gè)靶位點(diǎn)；根據(jù)每個(gè)靶位點(diǎn)人工合成一對(duì)互補(bǔ)并編碼短發(fā)夾狀小干擾RNA（small interference RNA,siRNA）的寡核苷酸鏈，將正、反義寡核苷酸鏈等比混合，退火形成DNA雙鏈，保存在-20℃?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)合成陰性對(duì)照；將DNA雙鏈克隆入能表達(dá)綠色熒光蛋白、抗性（新霉素）和人H1型RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子的真核質(zhì)粒表達(dá)載體，經(jīng)酶切鑒定正確后，命名為pEGFP-H1/Cyr61。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染使用RPMI-1640培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、100μg/mL鏈霉素和100IU/mL青霉素，并在37°C及5% CO2濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。為了構(gòu)建Cyr61敲減的MGC80-3細(xì)胞系，利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pEGFP-H1/Cyr61重組質(zhì)粒進(jìn)入MGC80-3細(xì)胞中。

1.4蛋 白 印 跡 （Western blot） 收 集 轉(zhuǎn) 染 后MGC80-3細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌兩次，在預(yù)冷的2×Lysis Buffer裂解，將裂解后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移入EP管，將細(xì)胞在冰上裂解10-15min后，應(yīng)用超聲破碎細(xì)胞。離心細(xì)胞15分鐘（4℃、12000g），吸取上清液，應(yīng)用BCA法測(cè)蛋白濃度。將所有樣本的蛋白濃度調(diào)整為2μg/μL，-80℃保存，備用。上樣，濃縮膠80V，20min；分離膠120V，1h。電泳后，利用轉(zhuǎn)移電泳裝置電轉(zhuǎn)2.5h（4℃、恒流300mA），再將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下用封閉液（含5%脫脂牛奶的TBST溶液）封閉1h。一抗孵育：加入封閉液將抗體稀釋?zhuān)缓笤谑覝叵屡c封閉好的PVDF膜孵育2h，用TBST緩沖液洗膜4次，每次8min。二抗孵育：將相應(yīng)二抗用封閉液稀釋?zhuān)跤?.5h（室溫），用TBST緩沖液洗膜4次，每次8min。最后用X光顯影。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌細(xì)胞MGC80-3及轉(zhuǎn)染pEGFP-H1/Cyr61細(xì)胞組胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)；均勻鋪板，細(xì)胞完全沉淀后，用顯微鏡觀察各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的細(xì)胞密度；第二天培養(yǎng)終止前4h，在孔中加入20μL5mg/mL的MTT，無(wú)需更換溶液；4h后完全吸出培養(yǎng)液并加入100μL DMSO溶解甲基贊顆粒；振蕩2~5min后酶標(biāo)儀490/570nm檢測(cè)OD值。

1.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的對(duì)照組和轉(zhuǎn)染pEGFP-H1/Cyr61細(xì)胞組，經(jīng)胰蛋白酶消化后重新懸浮于細(xì)胞懸浮液中并計(jì)數(shù)；根據(jù)細(xì)胞大小確定鋪板密度（50000cell/well），以第二日細(xì)胞數(shù)匯合度達(dá)到90%以上為準(zhǔn)。37℃、5% CO2培養(yǎng)，培養(yǎng)體系為100μL/孔（每組3復(fù)孔）；第二天，用劃痕測(cè)試儀對(duì)準(zhǔn)96孔板的中心，輕輕向上推，形成劃痕；使用PBS緩沖液輕輕漂洗2~3次，再加入含培養(yǎng)基（含1%FBS的血清）后掃板；37℃、5% CO2培養(yǎng)，選擇合適的時(shí)間，根據(jù)愈合程度用Celigo掃板；最后用Celigo分析0h、8h、24h遷移面積。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn) 將Transwell小室放置在24孔板中，上室加入100μL無(wú)血清培養(yǎng)基，放入37℃培養(yǎng)箱中1h；制備無(wú)血清細(xì)胞懸浮液（105/孔）；移除上室中的培養(yǎng)基，并加入100μL細(xì)胞懸液，下室中加入600μL 30% FBS培養(yǎng)基；37℃，培養(yǎng)8h；將小室倒扣于吸水紙上，去除培養(yǎng)基，用棉拭子去除小室內(nèi)的非轉(zhuǎn)移細(xì)胞，放置小室在4%多聚甲醛固定液中0.5h；固定后取出小室，吸干小室表面的固定液，將1-2滴染色液滴到膜的下表面染色轉(zhuǎn)移細(xì)胞1-3min，再將小室浸泡沖洗后晾干。每個(gè)transwell小室均隨機(jī)選取視野進(jìn)行顯微鏡拍照；應(yīng)用200×的照片計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)分析并比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的差異：計(jì)算各組轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)。

1.8血管生成實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞感染后，鋪2×105個(gè)細(xì)胞于6孔板中，待貼壁后用DPBS洗滌2次，更換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后收集上清液。將Matrigel 4℃過(guò)夜融化，-20℃預(yù)冷實(shí)驗(yàn)用的孔板及槍頭。Matrigel充分融化后，在預(yù)冷后的96孔板中每孔加入70μL Matrigel，凝固30min（37℃）備用。消化HMEC-1細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗2-3次，盡可能去除血清，加入預(yù)先收集的目的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，將細(xì)胞重懸為3×104細(xì)胞/100μL，鋪入96孔板。37℃培養(yǎng)2-4h后，棄去舊液，每孔加入50μL Calcein-AM濃 度 為0.2μM的 培 養(yǎng) 基37℃孵 育5～10min。熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞已被染色后，置于CQ1儀中掃板，獲得圖片及數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 qPCR檢測(cè)MGC-803細(xì)胞中Cyr61的表達(dá)量

結(jié)果顯示，基因Cyr61在MGC-803細(xì)胞中的表達(dá)豐度為高。如圖1。

圖1 qPCR檢測(cè)MGC-803細(xì)胞中Cyr61的表達(dá)量

2.2慢病毒感染人胃癌細(xì)胞MGC80-3

人胃癌細(xì)胞MGC80-3分別感染對(duì)照病毒NC和敲減Cyr61病毒KD，可明顯觀察到熒光。如圖2。

圖2 對(duì)照病毒NC和敲減Cyr61病毒KD感染后熒光圖

2.3 qPCR檢測(cè)Cyr61的表達(dá)量

MGC-803細(xì)胞中，相對(duì)于NC，KD1組Cyr61基因的敲減效率為27.1%；KD2組CYR61基因的敲減效率為45.8%。如圖3。

圖3 qPCR檢測(cè)敲減Cyr61病毒后MGC-803細(xì)胞中Cyr61的表達(dá)量

2.4 Western blot檢測(cè)Cyr61蛋白的表達(dá)量

Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲減Cyr61病毒KD1和KD2組條帶亮度顯著低于對(duì)照組NC。感染后細(xì)胞組Cyr61蛋白被顯著抑制。如圖4。

圖4 Western blot檢測(cè)敲減Cyr61后MGC-803細(xì)胞中Cyr61的表達(dá)量

2.5敲減Cyr61對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC80-3增殖能力的影響

應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)敲減Cyr61對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果顯示，相比對(duì)照組和敲減Cyr61組細(xì)胞的增殖能力無(wú)明顯變化，如圖5。

圖5 敲減Cyr61對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC80-3增殖能力的影響

2.6敲減Cyr61對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC80-3遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲減Cyr61基因后對(duì)人胃癌細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示，對(duì)照組遷移率為34.17%，敲減Cyr61細(xì)胞組遷移率為40.16%。P＞0.05,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即敲減Cyr61后對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力無(wú)影響。如圖6。

圖6 敲減Cyr61對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC80-3遷移能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲減Cyr61對(duì)人胃癌細(xì)胞遷移能力影響。結(jié)果顯示，對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)為121個(gè)，敲減Cyr61細(xì)胞組遷移細(xì)胞數(shù)為109個(gè)。P＞0.05,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即沉默CYR61后對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力無(wú)影響。如圖7。

圖7 敲減Cyr61對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC80-3遷移能力的影響

2.7敲減Cyr61對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC80-3侵襲能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲減Cyr61對(duì)人胃癌細(xì)胞侵襲能力影響。結(jié)果顯示，對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)為121個(gè)，敲減Cyr61細(xì)胞組侵襲細(xì)胞數(shù)為109個(gè)。P＞0.05,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即沉默CYR61后對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲能力無(wú)影響。如圖8。

圖8 敲減Cyr61對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC80-3侵襲能力的影響

2.8敲減Cyr61對(duì)人胃癌細(xì)胞凋亡的影響

相比對(duì)照組NC，敲減Cyr61的KD組凋亡數(shù)無(wú)明顯變化。P＜0.05，但是凋亡率小于5%，認(rèn)為并沒(méi)有發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象。如圖9。

圖9 敲減Cyr61對(duì)人胃癌細(xì)胞凋亡的影響

2.9敲減Cyr61對(duì)人胃癌細(xì)胞周期的影響

相比對(duì)照組NC，敲減Cyr61的KD組處于G1期的細(xì)胞經(jīng)過(guò)T-Test分析顯示P＜0.05，處于S期和G2/M期的細(xì)胞經(jīng)過(guò)T-Test分析P＞0.05。如圖10。

圖10 敲減Cyr61對(duì)人胃癌細(xì)胞周期的影響

2.10敲減Cyr61對(duì)血管形成的影響

相對(duì)對(duì)照組NC，敲減Cyr61的KD組血管形成能力明顯增加。如圖11。

圖11 敲減Cyr61對(duì)血管生成的影響

3 討論

Cyr61是生長(zhǎng)因子CCN家族中的成員。在包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤中異常表達(dá)。已有研究表明，Cyr61促進(jìn)胃癌，結(jié)腸癌[7]乳腺癌[8]等的進(jìn)展。然而，也有報(bào)道稱(chēng)，Cyr61可抑制非小細(xì)胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌等的進(jìn)展[5]。在關(guān)于胃癌的報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，與非腫瘤胃黏膜樣品相比，胃癌樣品中Cyr61的表達(dá)顯著上調(diào)。Cyr61的高表達(dá)與侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分化差、TNM分期晚期和5年生存率降低有關(guān)[9]，而本研究的結(jié)果顯示Cyr61不能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲，但也有實(shí)驗(yàn)研究表明，Cyr61在胃癌細(xì)胞增殖中起微不足道的作用[10]，這與本研究結(jié)果相符。還有多項(xiàng)研究表明Cyr61可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[11,12]，本研究結(jié)果未顯示出類(lèi)似結(jié)果。可能是受不同胃癌細(xì)胞系的影響，也可能因?yàn)楸旧鞢yr61在不同腫瘤中的表達(dá)量及對(duì)不同腫瘤的生物學(xué)功能的影響都存在差異。因此，其對(duì)胃癌進(jìn)展的影響還需進(jìn)一步研究。

深入研究機(jī)制發(fā)現(xiàn)可能與腫瘤細(xì)胞類(lèi)型中Cyr61引起不同通路的改變，以及腫瘤細(xì)胞對(duì)Cyr61誘導(dǎo)的凋亡及衰老是否敏感、或?qū)ρ苌梢蜃邮欠裣拗葡嚓P(guān)[13]。Cyr61可通過(guò)與細(xì)胞外基質(zhì)中的整合素以及硫酸乙酰肝素蛋白聚糖結(jié)合，以及與細(xì)胞外基質(zhì)中黏附的大量生長(zhǎng)因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子直接結(jié)合，對(duì)正常生理和病理過(guò)程中的細(xì)胞黏附、增殖、移動(dòng)、分化和新生血管形成起重要作用[14]。本研究通過(guò)檢測(cè)Cyr61對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期影響，也與其對(duì)胃癌生物學(xué)功能結(jié)果一致，均無(wú)影響。進(jìn)一步探究對(duì)血管生成影響的結(jié)果顯示，敲減Cyr61后血管形成能力明顯增加。這似乎與現(xiàn)有報(bào)道不相符。其原因可能是Cyr61對(duì)腫瘤的影響受多種因素的控制，是不同通路相互作用的結(jié)果。所以，更多的功能及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。