基于代謝組學(xué)研究長期慢性酒精暴露對大鼠氨基酸代謝途徑和神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響

李曉琳，劉舒靜，陳子愷，孔琬，黃善情，倪曉佳，張孜，楊燁，溫預(yù)關(guān)，2，尚德為，2

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院，廣東廣州 510370；2.廣東省精神疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510000）

2018 年世界衛(wèi)生組織報告指出，中國是酒精消費增長速度最快的國家，酒精消費增幅為76%[1]。2019 年對中國精神障礙患者的調(diào)查顯示酒精依賴患者的終身患病率為1.3%[2]。短暫適量飲酒對身體健康沒有造成明顯威脅，但長期慢性飲酒容易引起記憶力衰退、運動功能受損、冠心病等，并誘發(fā)成癮[3]。飲酒導(dǎo)致的一系列相關(guān)疾病，在嚴(yán)重?fù)p害身心健康的同時也給社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。研究表明，酒精可以影響多種受體及相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的異常[4]。長期慢性飲酒會導(dǎo)致酒精依賴，甚至成癮，對神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p傷。但其相關(guān)機制尚未完全明確，有研究發(fā)現(xiàn)，色氨酸作為生物體內(nèi)多種神經(jīng)活性物質(zhì)的前體，在調(diào)節(jié)神經(jīng)精神疾病中起重要作用，關(guān)于酒精暴露與色氨酸代謝的相關(guān)性被廣泛研究[5]。代謝組學(xué)是一種用于定量分析小分子代謝物的高通量分析工具，可對生物樣本如血液、尿液、組織等進(jìn)行檢測。因此，本研究從代謝組學(xué)出發(fā)，考察異常高酒精消耗中多種氨基酸代謝及神經(jīng)遞質(zhì)的差異變化，為酒精依賴機制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇、乙酸胺和氨水均為高效液相色譜級，購自美國Thermo Fisher Scientfifc公司。LC30A超高效液相（日本Shimadzu 公司）；QTRAP 4500 質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientfifc公司）；5425高速離心機（德國Eppendorf公司）；ZLS-1 真空離心濃縮儀（湖南赫西儀器裝備有限公司）；BT25S 電子分析天平（德國Sartorius 公司）；BSA124S-CW 電子分析天平（德國Sartorius 公司）；XW-80A 渦旋混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）。

1.2 實驗動物

6～7 周齡雄性SD 大鼠20 只，SPF 級，體質(zhì)量150～180 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2018-0002。

1.3 高酒精消耗大鼠模型的建立

使用單瓶強迫飲酒模型（20%酒精溶液）誘導(dǎo)高酒精消耗大鼠8周[6]。誘導(dǎo)過程中，每天需測量剩余酒精的質(zhì)量，并計算大鼠的酒精消耗水平。每周稱大鼠體質(zhì)量1 次。接著使用雙瓶自愿飲酒模型（20%酒精）篩選酒精高消耗大鼠持續(xù)1周，流程為：大鼠可以自由選擇酒精或者純水溶液，為避免位置偏好，每次重新放置酒瓶和純水溶液需要更換瓶子位置。每天稱量剩余酒精和純水質(zhì)量，并計算大鼠的酒精消耗水平[酒精占比=酒精消耗量/（純水消耗量+酒精消耗量）]。

由于在動物模型中，酒精成癮并沒有統(tǒng)一的評判標(biāo)準(zhǔn)，為了簡化模型的評價方法，參考現(xiàn)有的研究模型的建立方法，在本研究中將大鼠日酒精消耗量作為評價模型的終點指標(biāo)。高酒精消耗大鼠標(biāo)準(zhǔn)[7]：酒精誘導(dǎo)結(jié)束后，根據(jù)大鼠在篩選期內(nèi)1 周的酒精消費水平，酒精占比≥45%且1 周內(nèi)超過3 d 的被歸為高酒精消耗大鼠。

1.4 樣本提取及制備

在酒精誘導(dǎo)開始前及8 周后分別進(jìn)行眼眶取血。采集大鼠眼眶血約1 mL 于含抗凝管中離心處理（2 000g，25 ℃，10 min），收集上清液至0.5 mL 離心管中，并儲存于-80 ℃中進(jìn)行后續(xù)處理。

大鼠樣本血清處理：600 L冰甲醇（-80 ℃預(yù)冷）加到100 μL 血漿樣本中，渦旋混勻15 s，置于-80 ℃孵化約1 h，然后離心10 min（14 000g，4 ℃）。取500 μL 上清液真空干燥濃縮2.5 h（35 ℃）。再加入100 μL 50%乙腈復(fù)溶，渦旋靜置0.5 h。再次進(jìn)行離心10 min（14 000g，4 ℃），最后取100 μL 上清移至進(jìn)樣瓶。

1.5 代謝組學(xué)檢測方法

LC30A質(zhì)譜用于多種氨基酸及神經(jīng)遞質(zhì)。色譜柱：waters XBrige amide column（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）；流動相：（A）乙腈；（B）5%乙腈/95%水（含20 mmol乙酸銨+20mmol/L氨水，pH=9）。進(jìn)樣量5 μL，流速：0.5 mL/min。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.6 代謝組學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理是使用MS 定量軟件MultiQuantTM（AB SCIEX，美國）用于色譜峰的識別以及積分。StatTarget 是基于R 語言開發(fā)的組學(xué)統(tǒng)計分析工具，具有簡單易用的界面，提供基于質(zhì)控（QC）的組學(xué)數(shù)據(jù)校正和廣泛全面的統(tǒng)計分析。校正后的數(shù)據(jù)用于結(jié)果的統(tǒng)計分析。

采用Metaboanalyst 平臺進(jìn)行代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)經(jīng)均值中心化及標(biāo)度化處理。多元統(tǒng)計分析包括主成分分析法（PCA）以及偏最小二乘判別分析法（PLS-DA）及正交偏最小二乘判別分析方法（OPLS-DA）進(jìn)行置換檢驗，兩組之間的代謝物相對水平的比較顯示在熱圖層次聚類中。變量投影重要性（variable important on projection,VIP）值表示PLS-DA 中每個變量x變量對y變量的總體影響。VIP＞1 且校正后P＜0.05 的代謝物被認(rèn)為組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。將識別出的獨特代謝物輸入Metaboanalyst 平臺，參考P＜0.05 及影響值（impact value,IV）＞0.1 以獲得與酒精依賴相關(guān)的顯著差異代謝途徑。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以表示，采用t檢驗或方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測結(jié)果數(shù)據(jù)評價

根據(jù)高酒精消耗模型篩選標(biāo)準(zhǔn)[7]，篩選出10 只高酒精消耗大鼠。實驗選取第0 周（AA，對照組）和第8 周（FF，實驗組）的大鼠血清作為自身對照進(jìn)行代謝物差異分析。

QC 樣本被用以評價分析數(shù)據(jù)的質(zhì)量。本研究中所有代謝物的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于30%，此外PCA 模型（圖1）顯示經(jīng)過較正后的QC 樣本具有較好的聚集性，證明代謝組學(xué)檢測方法穩(wěn)定重復(fù)性良好，數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，數(shù)據(jù)滿足于下一步的統(tǒng)計分析。

圖1 校正后樣本質(zhì)控PCA圖Figure 1 PCA diagram of sample quality control after correction

2.2 長期慢性高酒精消耗大鼠血漿差異氨基酸及神經(jīng)遞質(zhì)篩選

通過考察代謝物信號校正后的RSD，最終對RSD小于15%的代謝物進(jìn)行統(tǒng)計分析。PLS-DA 模型用于比較AA 組和FF 組之間的代謝物差異（圖2A）。從OPLS-DA 的置換排列顯示，對照組和實驗組之間存在明顯差異，其模型預(yù)測能力的指標(biāo)值Q2為0.935（P＜0.01）和解釋能力的指標(biāo)值R2Y為0.995（P＜0.01），結(jié)果表明模型擬合準(zhǔn)確性好。

VIP 反映了代謝物對模型的貢獻(xiàn)。根據(jù)VIP＞1，鑒定出30 個潛在差異代謝物（圖2B）。在長期慢性飲酒過程中13個差異代謝物顯著上調(diào)，包括犬尿喹啉酸、色氨酸、血清素等；其余的顯著下調(diào)，包括谷氨酸、天冬氨酸等。另外繪制了Pearson相關(guān)的層次聚類熱圖分析顯示差異代謝物之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩組之間存在明顯的代謝物差異（圖2C）。

圖2 實驗組（FF）及對照組（AA）之間的差異代謝物Figure 2 Distinctive metabolites between the experimental group（FF）and the control group（AA）

2.3 差異代謝物通路富集分析

基于30 種潛在顯著差異代謝物（表2），導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路富集分析（pathway analysis），涉及的通路如表3 所示。根據(jù)P＜0.05 及影響值IV＞0.1 的通路，篩選出4 條差異顯著的代謝途徑，其中具有較高通路影響值的通路為色氨酸代謝（P=3.56×10-2，IV=0.299 55），丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（P=1.28×10-2，IV=0.420 68）。

表2 校正后兩組差異代謝物峰面積的比較Table 2 Comparison of peak areas of differential metabolites between the two groups after correction()

表2 校正后兩組差異代謝物峰面積的比較Table 2 Comparison of peak areas of differential metabolites between the two groups after correction()

表3 基于觀察到的代謝物差異顯著的通路途徑Table 3 Pathways with significant differences in metabolites observed

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，長期慢性高酒精消耗大鼠血清多種氨基酸及神經(jīng)遞質(zhì)等存在顯著差異。差異代謝物涉及多條代謝途徑，其中色氨酸代謝涉及的3 條代謝途徑（吲哚、犬尿氨酸、血清素）以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝變化較顯著。

鑒于犬尿氨酸通路代謝物的神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)毒性失衡與神經(jīng)精神疾病的發(fā)病機制有關(guān)，色氨酸代謝紊亂可能導(dǎo)致成癮的發(fā)生。血清素、犬尿喹啉酸、吲哚-3-丙酸是色氨酸代謝途徑的下游產(chǎn)物。色氨酸對谷氨酸受體具有拮抗作用，參與多種精神疾病的生物機制[8]。血清素屬于中樞興奮性遞質(zhì)，長期酒精暴露使體內(nèi)血清素水平上調(diào)，導(dǎo)致機體持續(xù)處于亢奮狀態(tài)。犬尿喹啉酸作為神經(jīng)系統(tǒng)有效的保護(hù)因子，與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生存在潛在相關(guān)性[9]。有研究通過抑制酒精依賴大鼠的犬尿氨酸-3-單加氧酶的活性，提高犬尿喹啉酸的合成[10]。結(jié)合本研究結(jié)果，作為犬尿氨酸代謝途徑下游產(chǎn)物之一的3-OH-鄰氨基苯甲酸是顯著下調(diào)的，推測在長期酒精暴露中大鼠可能通過抑制該酶的活性，引起犬尿喹啉酸水平上調(diào)，起到神經(jīng)保護(hù)作用。本研究結(jié)果（圖3A）顯示，實驗組動物血液中色氨酸和血清素上調(diào)，這也與朱秀清[11]研究得到的結(jié)論相似，表明在酒精依賴患者中色氨酸代謝可能依賴于色氨酸/血清素途徑。同時，研究結(jié)果顯示差異代謝物主要富集在色氨酸代謝途徑上，提示色氨酸代謝可能參與長期慢性酒精消耗誘發(fā)的相關(guān)疾病機制。

圖3 顯著通路的差異代謝物變化：色氨酸代謝（A）以及谷氨酸、天冬氨酸和N-氨基甲?；?L-天冬氨酸代謝（B）通路Figure 3 Differential metabolite changes in significant pathways: tryptophan metabolism (A) and alanine,aspartate and glutamate metabolism(B)pathways

丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝在過去研究被認(rèn)為是與酒精依賴相關(guān)的主要異常富集代謝途徑。有研究報道，酒精使用障礙患者的多個代謝途徑發(fā)生顯著改變，其中包括谷氨酸代謝、色氨酸代謝和組氨酸代謝等[12]。值得注意的是，本研究結(jié)果中，慢性高酒精消耗大鼠谷氨酸水平是顯著降低的（圖3B）。谷氨酸神經(jīng)傳遞系統(tǒng)異常涉及多種精神疾病的發(fā)病機制，對于酒精依賴患者，神經(jīng)傳遞系統(tǒng)中的谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)、相關(guān)轉(zhuǎn)運體及代謝酶的異常可能參與酒精依賴的潛在機制。有研究發(fā)現(xiàn)，慢性酒精暴露會增加伏隔核細(xì)胞外谷氨酸水平[13]，推測原因之一是酒精下調(diào)了谷氨酸轉(zhuǎn)運體的表達(dá)，突觸間隙的谷氨酸清除率降低，導(dǎo)致谷氨酸水平升高。雖然大多數(shù)研究表明，在一段時間的酒精暴露后，基礎(chǔ)谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)出現(xiàn)上調(diào)[14-16]。然而，并非所有研究都觀察到這種增加[17]。Moghaddam 等[18]研究指出，高劑量酒精暴露會抑制細(xì)胞外谷氨酸水平。在Mostofa 等[19]的研究中也得出了類似結(jié)論：高水平的酒精可以通過減弱海馬體的谷氨酸受體表達(dá)來降低谷氨酸水平。在高劑量酒精的誘導(dǎo)下，潛在解釋了在本研究中谷氨酸水平下調(diào)的部分原因。在γ-氨基丁酸（GABA）和N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDA）受體是參與酒精依賴的兩個主要受體，被認(rèn)為是異常酒精消耗的重要目標(biāo)[20-21]。結(jié)合本研究結(jié)果中，對于谷氨酸水平的下調(diào)，推測原因之一是在長期且高劑量酒精消耗時，GABA 對谷氨酸能神經(jīng)傳遞的抑制作用占主導(dǎo)，從而抑制了谷氨酸的釋放。另外，雖然有研究發(fā)現(xiàn)長期慢性酒精暴露小鼠在戒斷時期細(xì)胞外谷氨酸水平是增加[22]，但考慮本研究大鼠血清樣本采集時，大鼠仍處于持續(xù)的酒精消耗狀態(tài)，故大鼠沒有表現(xiàn)出明顯戒斷癥狀，這也可能是沒有引起谷氨酸水平上調(diào)的另一原因。此外，在谷氨酸與谷氨酰胺代謝途徑中，谷氨酰胺合成酶參與催化谷氨酸和銨離子合成谷氨酰胺，因此本研究還考察了谷氨酰胺的變化趨勢。雖然谷氨酰胺水平在統(tǒng)計中沒有表現(xiàn)出顯著趨勢，但根據(jù)其變化趨勢，在長期慢性酒精消耗大鼠中谷氨酰胺水平是升高的，故谷氨酸的下調(diào)與該通路可能有潛在相關(guān)性[23，24]，但該通路在長期慢性高酒精消耗發(fā)揮的作用需要進(jìn)一步驗證。

同時，天冬氨酸也作為腦內(nèi)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之一，本研究中實驗組大鼠血液中天冬氨酸水平是顯著降低，與張紹輝等[25]在酒精依賴大鼠的結(jié)論相似。另外，Hinton 等[26]研究指出，天冬氨酸可以作為治療酒精依賴疾病的潛在生物標(biāo)記物。鑒于本研究檢測的是血液樣品，這兩種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)在腦組織內(nèi)的變化水平尚未可知。

總的來說，本研究結(jié)果從外周血清水平證實了長期慢性高酒精消耗可以顯著影響某些氨基酸代謝物及神經(jīng)遞質(zhì)的水平，其顯著的代謝物特征有利于闡明異常酒精消耗的潛在分子機制。從代謝通路分析來看，色氨酸代謝途徑上代謝物的變化是顯著的，提示色氨酸代謝與異常酒精消耗存在相關(guān)性。另外，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，組氨酸代謝，精氨酸生物合成均涉及谷氨酸與天冬氨酸，這兩個指標(biāo)可能是誘發(fā)異常酒精消耗的敏感指標(biāo)[27]。由于分組間統(tǒng)計數(shù)據(jù)可能存在偏倚，未來的研究將集中在更多的亞組分析，以盡量減少混雜效應(yīng)因素的影響。