獼猴桃Aux/IAA基因家族的鑒定與表達

蘇麗艷

(西安文理學院 生物與環境工程學院，陜西省航天育種工程中心，西安 710065)

生長素作為重要的植物激素之一，在植物的生長發育，如細胞分裂與伸長、器官形成、果實的發育等過程有重要的調控作用[1-2]。Aux/IAA是生長素信號早期響應因子之一，在生長素濃度較低時，Aux/IAA通過與生長素響應因子(auxin response factor,ARF)形成異源二聚體抑制生長素信號轉導過程；當生長素濃度較高時，Aux/IAA發生降解，釋放ARF，調控下游靶基因的表達[3-4]。典型的Aux/IAA基因含有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 四個保守的結構功能域，結構域 Ⅰ 包含保守的亮氨酸重復基序LxLxLx，抑制生長素下游調控基因。結構域 Ⅱ 保守的GWPPV 基序與 F-box 蛋白 TIR1 相互作用，導致 Aux/IAA 的不穩定性和快速降解。位于 C 端的結構域 Ⅲ和 Ⅳ 能與其他 Aux/IAA 或 ARF 相互作用，形成同源二聚體和異源二聚體，從而調控下游基因表達[5-6]。

隨著植物基因組測序的完成，Aux/IAA家族基因在多種植物中均已分離與鑒定。如擬南芥中分離鑒定Aux/IAA家族基因29個，水稻31個，番茄26個，黃瓜27個，玉米34個，草莓21個，且在小麥、葡萄、毛白楊和苜蓿等物種中均已被分離和鑒定[7-15]。Aux/IAA家族基因在植物發育過程中的功能也被廣泛研究。在擬南芥中研究表明，iaa3/shy2、iaa7/axr2、iaa14/slr、iaa17/axr3、iaa28等 Aux/IAA 家族基因均參與擬南芥側根的形成過程[16-18]；水稻OsIAA1、OsIAA11及OsIAA23亦在根的發育過程中有重要調控作用[19-20]；在番茄中，Sl-IAA9、Sl-IAA15、Sl-IAA17、Sl-IAA27等Aux/IAA 家族基因均參與調控番茄的根、葉及果實的發育過程[21-24]。

獼猴桃，又稱奇異果，因其品質鮮嫩，營養豐富而受到廣泛歡迎。紅陽獼猴桃屬中華獼猴桃(Actinidiachinensis)中的紅肉獼猴桃變種，栽培過程中經常受到各種的非生物脅迫，如干旱、寒冷、鹽分和激素脅迫。紅陽獼猴桃全基因組測序的完成為鑒定基因家族成員的數量及預測其功能提供了重要的數據資源。本研究借助生物信息學手段分離鑒定獼猴桃Aux/IAA(AcIAA)家族成員，并對其序列特征、染色體定位、基因結構、順式作用元件，不同組織及激素脅迫的表達模式進行分析，為進一步通過基因工程手段分析該家族基因在獼猴桃發育過程中的功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料及取樣

紅陽獼猴桃由陜西省周至縣佰瑞獼猴桃研究院提供。植物組織取樣自3株5年生(2016-2021)紅陽獼猴桃嫁接樹(嫁接砧木為佰瑞研究院自主培育品種YZ31012)，包括根、莖、葉(春季幼葉第4片)、花、小果 (約花后30 d)、熟果 (約花后120 d)，每種組織取3次重復。激素處理植株選取苗長約25 cm，含有6～8片葉的2年生嫁接苗。植物激素噴施于葉片上，處理濃度為100 μmol·L-1，對照組用超純水處理。處理及對照組分別在處理0、1、6和12 h 取材，每個處理3次重復，每個重復選取長勢較好的6株嫁接幼苗，每個樣品含有6片不同植株的葉片。所有植物材料液氮冷藏于-80 ℃。

1.2 方 法

1.2.1 Aux/IAA家族基因的鑒定紅陽獼猴桃基因組數據下載于Ensembl Plants (http://plants.ensembl.org/index.html)，包括gff文件、蛋白序列和核酸序列文件[25]。IAA 基因家族的 HMM 模型(PF02309)下載于Pfam 數 據 庫(http://pfam.xfam.org/)，利用 HMMER 軟件包的 hmmsearch 程序在獼猴桃基因組氨基酸序列中進行搜索(E<1 × 10-5)，用 Perl 腳本提取候選蛋白的序列信息，比對到 Pfam數據庫預測候選序列所含的結構域，保留含有IAA家族基因結構域的序列即為獼猴桃IAA家族成員初篩結果，再利用在線網站SMART (http://smart.embl-heidelberg.de) 及NCBI-CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/ cdd/wrpsb.cgi)數據庫進行結構域預測檢驗，確定Aux/IAA成員組成。

1.2.2 生物信息學分析利用在線工具 ExPASy(https：//web.expasy.org/protparam/)分析 Aux/IAA家族蛋白的分子質量、等電點信息；使用 CELLO(http：//cello.life.nctu.edu.tw/)進行蛋白亞細胞定位預測；利用MapChart V2.1進行染色體定位分析，通過 MEGA X 軟件采用鄰接法(neighbour-joining，NJ)構建進化樹，利用meme軟件做motif分析；利用 GSDS 2.0(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/)進行基因結構分析；利用Clustalw 軟件進行蛋白序列比對；通過 MCScanX 程序分析基因復制事件，DSP software展示獼猴桃和擬南芥Aux/IAA 基因共線性關系，運用擬南芥和獼猴桃之間PMEI 共線線性基因對計算 Ka 和 Ks 值，計算分化時間 T= Ks/2R；利用 PlantCARE 對獼猴桃Aux/IAA基因起始密碼上游 1.5 kb 啟動子的順式作用元件進行查找和統計分析；基因定位利用WoLF PSORT在線網站完成。

1.2.3 實時熒光定量PCR分析獼猴桃葉片總RNA采用去多糖多酚試劑盒(天根，北京)提取，并利用反轉錄試劑盒合成cDNA(天根，北京)。以cDNA 為模板，利用ABI Quant Studio tm 6 Flex熒光定量PCR系統進行qPCR 檢測。采用SYBR Green Master Mix (ROX，瑞士)試劑盒進行擴增反應，反應總體系為20 μL，包含SYBR Green Master Mix 10 μL，1 μL cDNA (30 ng · μL-1) 模板，上、下游引物 (10 μmol·L-1) 各1 μL，1 μL cDNA (30 ng · μL-1)模板，無菌水7 μL。擴增程序為 95 ℃預變性 30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，共 40 個循環。選取ACT2 基因 (GenBank:EF063571)為內參，用在線工具 Primer 3.0(http：//primer3.ut.ee/)設計AcIAA家族基因特異性引物(表1)，采用 2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平。

表1 實時熒光定量PCR所用引物Table 1 All the primers for quantitative real-time PCR

續表1 Continued Table 1

2 結果與分析

2.1 獼猴桃AcIAA家族成員的鑒定及染色體定位

經過分析與鑒定，確定獼猴桃AcIAA家族包含50個成員(表2)。根據其在染色體上的定位信息進行命名，若X號染色體上包含多個成員，則命名為AcIAA Xa、AcIAA Xb 以此類推。AcIAA家族成員氨基酸大小介于125～391 aa,分子量介于14.06～42.48 kD，等電點介于 4.33～9.51。內含子在1～5個不等。染色體定位分析表明，50個基因不均等地分布于21條染色體上，其中23號染色體上分布最多，共11個。

表2 獼猴桃AcIAA家族成員基本信息Table 2 Basic information of AcIAA family in A. chinensis

2.2 獼猴桃AcIAA家族成員進化關系分析

通過NJ方法構建獼猴桃AcIAA家族成員進化樹，對50個基因的進化關系進行分析。根據親緣關系遠近可將其分為9組，進化樹聚集在同一分支的成員間通常具有相似的基因結構和保守元件，可能在進化過程中具有相似的功能，不同的分支在長期的進化過程中可能出現了功能的分化(圖1)。

圖1 獼猴桃與擬南芥中Aux/IAA家族進化關系分析Fig.1 Phylogenetic relationships of Aux/IAA family between A. thaliana and A. chinensis

2.3 獼猴桃AcIAA家族成員基因結構及保守元件分析

基因結構分析表明，獼猴桃AcIAA家族成員所含內含子數1～5個不等，外顯子數2～7個不等。其中，結構較為簡單的AcIAA18a和AcIAA24a含有1個內含子，結構較復雜的AcIAA4、AcIAA11a和AcIAA21a含有5個內含子(圖2)。15個保守元件分析結果表明，50個AcIAA包含元件的種類和數量不等，Motif 2在50個基因中均含有，而Motif1、Motif3和Motif4存在于大部分家族成員中。

圖2 AcIAA家族進化關系、基因結構及保守元件分析Fig.2 Phylogeny,motifs,and exon-intronic structures of AcIAAs

續表2 Continued Table 2

2.4 Aux/IAA家族基因共線性分析

由于基因重復能顯著促進基因家族的擴展和蛋白質功能的多樣化，本研究分析了AcIAA家族基因在獼猴桃基因組內(圖3)及與擬南芥基因組間的基因復制事件(圖4)。結果表明，組內篩選到23組重復事件AcIAA基因對，包括20對片段重復和3對串聯重復(AcIAA23k/AcIAA23h、AcIAA23j/AcIAA23g、AcIAA23b/AcIAA23a)。組間篩選到24個AcIAA基因與擬南芥IAA家族基因形成了36組共線性關系(圖4)，基因組共線性分析可以預測AcIAA基因在種內和種間的序列同源性，同源基因可能具有相似的功能，因此全基因組共線性分析對于關鍵基因功能預測提供了線索。

圖3 獼猴桃AcIAA家族基因共線性分析Fig.3 Collinear prediction of AcIAA family genes in A. chinensis

圖4 獼猴桃與擬南芥基因組間Aux/IAA家族基因共線性分析Fig.4 Collinear prediction of Aux/IAA family genes between A. thaliana and A. chinensis

2.5 Aux/IAA家族基因啟動子結構分析

對AcIAA家族成員啟動子區1 500 bp序列進行了順式作用元件分析。結果表明(表3)，50個AcIAA基因含有多種植物激素應答及脅迫響應元件，包括生長素、赤霉素、脫落酸、茉莉酸甲酯、水楊酸、厭氧誘導、脅迫反應、干旱及低溫等，預測該基因家族在獼猴桃形態建成及激素互作調控果實生長發育及逆境脅迫方面發揮著重要作用。此外，AcIAA基因均含光響應元件，且部分基因含有組織特異性(胚乳、分生組織等)。

表3 獼猴桃AcIAA基因家族基本信息Table 3 Basic information of AcIAA gene family in A. chinensis

2.6 Aux/IAA家族基因組織表達特異性分析

qRT-PCR檢測發現，AcIAA基因在6種不同組織中均有表達，表達模式差異明顯(圖5)。AcIAA23k、AcIAA9b、AcIAA11c、AcIAA28a分別在根、莖、葉片和花中的表達量最高，其中AcIAA28a在果實發育過程中始終維持相對較高表達水平，說明該基因可能在果實整個發育過程中有重要的調控作用；AcIAA12c和AcIAA28b分別在小果和成熟果實中表達量最高。

圖5 獼猴桃AcIAA基因在不同組織中表達熱圖Fig.5 The heatmap of AcIAA gene in different tissues of A. chinensis

2.7 AcIAA對外源激素IAA的響應模式分析

研究表明，Aux/IAA家族的基因作為生長素原初反應基因在激素互作調控植物生長發育過程有重要的功能。本研究篩選15個AcIAA基因為目標基因，利用qRT-PCR對其在植物激素IAA處理后的響應模式進行分析。結果(圖6，A)顯示，AcIAA3a、AcIAA5、AcIAA9b、AcIAA11b、AcIAA12c、AcIAA21a、AcIAA23j、AcIAA23k共8個基因在IAA處理后迅速響應，1 h后呈現顯著性下調表達且持續到12 h后，特別是AcIAA9b持續保持顯著下調表達趨勢，其他基因后期表達量較處理初期有上升趨勢，但仍然低于同期對照組；同時，AcIAA12b、AcIAA16d、AcIAA23e、AcIAA24b4個基因在IAA處理1和6 h后表達量顯著下調，12 h后恢復正常水平；AcIAA25在IAA處理12 h呈現下調表達，應答速度較其他基因遲緩；AcIAA1a和AcIAA18a在IAA處理1 和6 h后表達量呈現一定的上調趨勢，處理后期恢復正常表達水平(圖6，B)。不同的基因對外源激素均有一定的響應，表明其參與了植物激素生長素對獼猴桃果實發育的調控過程。本研究檢測的15個基因中，有13個基因的相對表達量在IAA處理不同時期呈現下調趨勢，說明植物激素生長素對其有負調控作用；同時，有2個基因受到生長素的正向調控，因此，響應模式的差異也說明了Aux/IAA家族各個基因在調控獼猴桃發育過程中功能上的差異性。

3 討 論

Aux/IAA家族基因作為重要的轉錄調控因子廣泛參與植物生長發育各階段及逆境響應過程[26-27]。本研究在獼猴桃基因組中鑒定出50個Aux/IAA基因，多數成員均含有Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ結構域，部分基因缺失Ⅰ結構域，基因進化樹同一分枝基因結構具有相似性，少量基因結構存在特異性，推測可能在獼猴桃進化過程中基因受到環境脅迫導致序列的缺失。

目前，Aux/IAA家族基因在很多物種中已被鑒定分離，前期研究表明，Aux/IAA家族基因在進化過程中存在較多的基因復制事件，本研究鑒定的50個基因中存在基因復制對共23組，包括20對片段重復和3對串聯重復，基因擴張可能是在進化過程中發生了全基因組復制使連鎖群加倍導致的[28]，而Aux/IAA 基因擴張產生的功能冗余或多樣性可為獼猴桃適應環境提供動力。獼猴桃與擬南芥基因組間形成36組共線性關系，根據獼猴桃與擬南芥Aux/IAA 基因間同源關系將Aux/IAA家族基因分為9組，同源基因功能可能存在相似性。從啟動子順式作用元件分析可知Aux/IAA家族基因含有大量激素響應、脅迫應答及生長發育調控相關的元件。以上結果可為進一步了解獼猴桃AcIAA基因的功能提供線索。

Aux/IAA家族基因在獼猴桃不同植物組織中的表達模式不同，表示該家族基因具有功能多樣性，存在基因復制現象的基因部分表現出組織表達模式相似性，推測在功能上可能有冗余，如AcIAA1b和AcIAA9b，AcIAA15a和AcIAA16a，AcIAA11a和AcIAA21a；AcIAA11c和AcIAA16d，AcIAA12b和AcIAA20b。選取15個AcIAA基因分析其在植物激素IAA處理后的響應模式，15個基因均對外源激素處理作出應答，但其響應的時間和強度各有不同。其中，絕大多數基因均在激素處理的早期反應強烈，而后漸恢復，說明Aux/IAA家族基因中多數成員在響應生長素信號的早期發揮作用，且外源激素IAA對其有負向調控作用；被檢測基因中僅有兩個基因呈現一定上調表達，表明IAA對其有一定的正向調控作用，說明Aux/IAA家族基因直接或間接地參與了生長素調控獼猴桃生長發育的過程。

續表3 Continued Table 3

0h-C、1h-C、6h-C、12h-C與0h-I、1h-I、6h-I、12h-I分別為對照組與IAA處理組在0、1、6和12 h樣品；不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05)圖6 外源激素IAA處理后AcIAA基因表達模式0h-C,1h-C,6h-C,12h-C and 0h-I,1h-I,6h-I,12h-I are control and IAA treatment samples at 0,1,6 and 12 hours;The different normal letters indicate significant differences at the 0.05 level (P<0.05)Fig.6 Expression patterns of AcIAA genes under exogenous hormones IAA treatment

近期有大量研究表明Aux/IAA家族基因在植物果實的發育，特別是果實早期發育過程中有重要調控作用。如在番茄中，SlIAA3抑制表達后引起包括頂端優勢在內的生長素及乙烯相關表型的改變[29]，SlIAA9使番茄座果過程提前發生[21]，Sl-IAA27下調后影響果實大小[23]，Sl-IAA17則通過影響細胞的膨大過程使番茄果實增大[24]。獼猴桃Aux/IAA家族基因如何參與調控其生長發育過程，是否存在功能冗余現象，在生長素信號通路中的主要調控網絡如何，如何對激素的調控作出響應，均有待進一步分析研究。