氣相色譜-質譜聯用法測定液體調味料中4種氯丙醇的含量

劉沁穎，侯 靖，毛燕妮，盧躍鵬，周曉婷

（1.武漢食品化妝品檢驗所，湖北 武漢 430040；2.國家市場監管重點實驗室（食用油質量與安全），湖北 武漢 430040）

氯丙醇類化合物是一種人們公認的在食品加工過程中產生的污染物，包括3-氯-1,2-丙二醇（3-chloro-1,2-propanediol，3-MCPD）、2-氯-1,3-丙二醇（2-chloro-1,3-propanediol，2-MCPD）、1,3-二氯-2-丙醇（1,3-dichloro-2-propanol，1,3-DCP）和2,3-二氯-1-丙醇（2,3-dichloro-1-propanol，2,3-DCP），具有腎臟毒性、生殖毒性、免疫抑制和潛在致癌性[1-2]。1993年，世界衛生組織對氯丙醇類物質的毒性發出警告；2011年，國際癌癥研究機構評估3-MCPD的毒性后將其歸為2B類，認為它是一種對人類致癌性證據有限的可能致癌物。齊麗娟等[3]基于系統文獻檢索對3-MCPD及其酯類經口暴露的危害進行評估，動物研究顯示3-MCPD毒性效應主要靶器官為腎和睪丸。動物長期低劑量暴露可引起雄性大鼠進行性腎毒性、睪丸毒性以及雌性大鼠腎毒性和乳腺增生，從而導致動物生育能力下降，表現出精子活性降低、產仔數量減少和完全不育等生殖毒性。小鼠短期高劑量暴露還可引起神經毒性作用。在最近的文獻報道中，SEVIM ? 等[4]通過大鼠腦組織中miR-21和PTEN-Akt等的表達情況，發現3-MCPD和縮水甘油亞可誘導大鼠腦組織凋亡。JIN C N等[5]采用3-MCPD灌胃大鼠28 d后，腎臟組織中發現有975個蛋白出現失調。生物信息學分析顯示，3-MCPD可導致內源性代謝中與氨基酸、脂質和碳水化合物代謝相關的幾種酶發生改變，參與這些通路的一些蛋白也發生了變化，這為腎毒性的分子機制提供了更全面的認識。LEE H S等[6]使用C2C12成肌細胞評估了3-MCPD的體外肌肉毒性，發現3-MCPD通過抑制mTOR和p70S6激酶表達從而對肌肉分化產生抑制作用。SCHULTRICH K等[7]研究發現，氧化應激可能在3-MCPD毒性中起作用，在腎臟、睪丸和大腦三個器官中，氧化應激的生物標志物不可逆氧化DJ-1蛋白的數量在喂食低劑量的3-MCPD時即顯著增加。FAN Y等[8]研究發現，1,3-DCP作用于AKT/mTOR/FOXO1信號通路抑制自噬導致脂質積累，使實驗小鼠表現出肝臟中甘油三酯、總膽固醇和脂滴數量增加。

液體調味料中氯丙醇的主要來源為水解植物蛋白，其為植物性蛋白質在酸催化作用下，水解后的產物，主要成分是氨基酸。由于植物性原料中有脂肪的存在，在使用過量鹽酸水解時，甘油三酯也會水解為丙三醇，并與鹽酸進一步反應產生各種氯丙醇。另外有報道[9]稱紙制品生產過程中可能會添加增強抗濕性的環氧氯丙烷，當紙制品接觸到液態食品時，其中的環氧氯丙烷可分解成氯丙醇，進而遷移到食品中造成污染。曾瑩等[10]報道紙制品中1,3-DCP與3-MCPD遷移被普遍檢出。因此，建立液體調味料中氯丙醇含量檢測方法很有必要。

現有氯丙醇檢測方法主要有氣相色譜-質譜聯用法（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）、毛細管電泳-電化學檢測法[11]、高效液相色譜-熒光檢測法[12]、近紅外光譜法[13]、電化學傳感器法[14]以及比色法[15]等，其中，使用最廣泛的是氣相色譜-質譜聯用法。氯丙醇的提取分離多采用固相支持液液萃取技術，常用的載體有硅膠[16]、氧化鋁[17-18]和硅藻土[19-21]。氯丙醇為極性化合物，為了提高檢測靈敏度，需要進行衍生處理，常見的衍生劑有七氟丁酸酐[16-17，21]、七氟丁酰基咪唑[19]、六甲基二硅氮烷與三甲基硅基三氟甲烷磺酸鹽[18]、環己酮[20]和苯硼酸[22-23]。近幾年也有非衍生化檢測氯丙醇的報道，但需要結合凝膠色譜[24]或高分辨質譜[25]，難以推廣。本研究擬參考美國分析化學家協會（association of official analytical chemists，AOAC）方法，選取醬油、魚露及水解植物蛋白液為液體調味料的代表，采用商品化硅藻土柱進行固相支持液液萃取，七氟丁酰基咪唑衍生，氣相色譜-質譜聯用檢測，通過對前處理條件進行一系列優化，建立了一種前處理簡單快捷的液體調味料中氯丙醇含量測定方法，為分析液體調味料及其他食品中的氯丙醇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀造醬油、魚露、水解植物蛋白液：購于武漢市場。

正己烷、乙酸乙酯（均為色譜純）：德國Merck公司；氯化鈉、無水硫酸鈉（均為分析純）：國藥試劑化學有限公司；七氟丁酰基咪唑（色譜純）：美國REGIS公司。

3-氯-1,2-丙二醇（3-MCPD）、2-氯-1,3-丙二醇（2-MCPD）、1,3-二氯-2-丙醇（1,3-DCP）、2,3-二氯-1-丙醇（2,3-DCP）、D5-3-氯-1,2-丙二醇（D5-3-MCPD）、D5-2-氯-1,3-丙二醇（D5-2-MCPD）、D5-1,3-二氯-2-丙醇（D5-1,3-DCP）和D5-2,3-二氯-1-丙醇（D5-2,3-DCP）標準物質（純度均＞99%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設備

7890B-5977B氣相色譜-質譜聯用儀、DB-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國Agilent公司；Vortex-Genie 2渦旋混勻器：美國Scientific Industries公司；N-EVAP111氮氣濃縮儀：美國Organomation Associates Jnc.公司；大孔硅藻土柱（12 mL）：北京迪馬科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑與標準溶液配制

配制20%氯化鈉溶液、1 000 mg/L氯丙醇及氘代氯丙醇標準儲備液、氯丙醇混合標準中間液（10 mg/L）及氘代氯丙醇混合標準工作液（10 mg/L）。

1.3.2 樣品前處理

稱取4 g液體樣品于15 mL離心管中，對于不含食鹽的試樣，稱樣后加入1 g氯化鈉，準確加入氘代氯丙醇混合標準工作液20 μL，超聲混勻5 min，待凈化。將液體全部轉移至硅藻土小柱中，平衡10 min。以10 mL正己烷淋洗，棄去流出液，以15 mL乙酸乙酯洗脫氯丙醇，收集洗脫液于玻璃離心管中。在洗脫液中加入4 g無水硫酸鈉，振搖，放置10 min后過濾，轉移濾液至密閉性很好的透明具蓋玻璃瓶中，氮吹濃縮至約0.5 mL（切忌濃縮至干），用2 mL正己烷溶解，渦旋混合。用氣密針加入0.04 mL七氟丁酰基咪唑，立即擰緊瓶蓋，渦旋混合30 s，于70 ℃反應20 min。取出冷卻至室溫，加入2 mL 20%氯化鈉溶液，渦旋混合1 min，靜置使水相和正己烷相分層，轉移正己烷相，加入約0.3 g無水硫酸鈉進行干燥后供氣相色譜-質譜測定。系列標準工作液同步衍生化。

1.3.3 氣相色譜-質譜分析條件

GC條件：DB-5MS毛細管柱（0.25 μm×0.25 μm，30 m）；載氣為高純氦氣（He）（純度≥99.999%）；流速為1 mL/min；進樣口溫度為250 ℃；不分流進樣，進樣量1 μL；升溫程序為50 ℃保持1 min，以2 ℃/min升至90 ℃，再以40 ℃/min升至270 ℃，并保持5 min。

MS條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；離子源溫度280 ℃；溶劑延遲時間8 min；監測方式為選擇離子監測（selected ion monitoring，SIM），各化合物定量及定性、定量離子信息見表1。

表1 各化合物定量及定性離子Table 1 Quantitative and qualitative ion of each compounds

續表

1.3.4 數據分析

采用Agilent MassHunter 11.0軟件采集數據并分析，采用Microsoft Office Excel 2016對實驗數據進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 色譜柱的選擇

氯丙醇的衍生物極性較小，一般使用弱極性色譜柱進行分離。因此，比較了5%苯基亞芳基聚合物毛細管色譜柱（DB-5MS）和5%苯基-甲基聚硅氧烷毛細管色譜柱（HP-5MS）對分離效果的影響。結果表明，同樣升溫條件下，使用HP-5MS色譜柱分離時，3-MCPD與2-MCPD無法完全分開，分離度為1.2；而使用DB-5MS色譜柱分離時，3-MCPD與2-MCPD可以基線分離，所以選擇DB-5MS色譜柱進行實驗。使用DB-5MS色譜柱對4種氯丙醇及其氘代內標物進行分離，總離子流色譜圖見圖1。

圖1 4種氯丙醇及其氘代內標物GC-MS分析的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of 4 kinds of chloropropanols and their deuterated internal standards analyzed by GC-MS

2.2 淋洗溶液對結果的影響

正己烷淋洗可以除去提取液中的脂類等非極性干擾物，但是正己烷淋洗也可能會造成目標物的損失。分別稱取4份液體樣品4 g進行加標實驗，分別用0、10 mL、20 mL和30 mL正己烷淋洗，檢測淋洗液及后續15 mL乙酸乙酯洗脫液中氯丙醇含量。結果表明，不加正己烷淋洗不能有效除脂，后續實驗過程中易出現乳化現象；1,3-DCP與2,3-DCP易被正己烷洗脫，10 mL正己烷淋洗即可使1,3-DCP與2,3-DCP發生明顯的損失，3-MCPD與2-MCPD不易被正己烷洗脫；而20 mL和30 mL淋洗后，4種物質均有非常明顯的損失。綜合考慮，選擇10 mL正己烷進行淋洗除脂。

2.3 洗脫體積對結果的影響

稱取5份試樣4 g液體樣品進行加標實驗，先使用10 mL正己烷淋洗，再分別用10 mL、15 mL、20 mL、25 mL和30 mL乙酸乙酯洗脫，檢測洗脫液中氯丙醇含量。結果表明，4種氯丙醇的最佳洗脫體積均為25 mL，但1,3-DCP與2,3-DCP相比，3-MCPD與2-MCPD受洗脫體積的影響較小。在洗脫體積為15 mL時1,3-DCP與2,3-DCP洗脫含量約為最佳洗脫體積時的90%，3-MCPD與2-MCPD洗脫含量約為最佳洗脫體積時的80%。考慮到洗脫體積過大會顯著增加后續氮吹的時間，增加檢測成本，故洗脫體積確定為15 mL。

2.4 洗脫液吹干對結果的影響

氯丙醇為小分子化合物，沸點較低。為了考察溶液吹干對實驗的影響，配備了含4種氯丙醇0.1 mg/L的溶液，一份在氮氣下水浴吹干約5 min后拿出，2 mL正己烷復溶后衍生；另一份直接衍生。結果表明，1,3-DCP與2,3-DCP吹干后幾乎全部損失，3-MCPD與2-MCPD吹干后也有較大損失，故洗脫溶劑切忌完全吹干。

2.5 衍生后溶液的穩定性

將衍生好的標準溶液分裝在4個樣品瓶中，分別在常溫、避光常溫、避光4 ℃和避光-18 ℃條件下保存，于0 d、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d時上機檢測（每次進樣后立即更換新瓶蓋，并移至規定條件下保存），記錄各化合物在不同保存時間的峰面積。結果發現，4種氯丙醇及4種內標化合物在各條件下均非常穩定，7 d內沒有明顯的峰面積改變，說明衍生后的溶液穩定性良好。

2.6 方法驗證

2.6.1 檢出限、定量限與線性范圍

分別稱取4 g空白樣品，加入一定量的氯丙醇標準中間液，制備含4種氯丙醇的加標樣品，經處理后按1.3.3條件進行檢測，以3倍信噪比計算檢出限，以10倍信噪比計算定量限。以化合物質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，得到回歸方程，4種氯丙醇的檢出限、線性范圍與回歸方程見表2。

表2 4種氯丙醇的檢出限、定量限、線性范圍與回歸方程Table 2 Limits of detection,limit of quantitation,linear ranges and regression equation of 4 kinds of chloropropanols

由表2可知，3-MCPD、2-MCPD、1,3-DCP和2,3-DCP的檢出限分別為2.0 μg/kg、2.0 μg/kg、5.0 μg/kg、5.0 μg/kg，定量限分別為5.0 μg/kg、5.0 μg/kg、10 μg/kg、10 μg/kg，在0.005～1.6 μg/mL質量濃度范圍內具有很好的線性關系。R2均為0.999。

2.6.2 回收率與精密度實驗結果

分別稱取4 g空白樣品，分別加入氯丙醇，制備成加標樣品。每個質量濃度的加標樣品各6份，經處理后采用1.3.3條件進行檢測，扣除未加標樣品本底值后計算4種氯丙醇的回收率和精密度實驗結果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果見表3～表5。

表3 醬油中4種氯丙醇回收率與精密度（n=6）Table 3 Recovery rates and precisions of 4 kinds of chloropropanols in soy sauce (n=6)

表4 魚露中4種氯丙醇回收率與精密度（n=6）Table 4 Recovery rates and precisions of 4 kinds of chloropropanols in fish sauce (n=6)

表5 水解植物蛋白液中4種氯丙醇回收率與精密度（n=6）Table 5 Recovery rates and precisions of 4 kinds of chloropropanols in hydrolyzed vegetable protein liquid (n=6)

由表3可知，醬油中4種氯丙醇的平均回收率在85.9%～107.0%范圍內，RSD在1.08%～8.58%范圍內；由表4可知，魚露中4種氯丙醇的平均回收率在85.6%～106.0%范圍內，RSD在0.85%～4.69%范圍內；由表5可知，水解植物蛋白液中4種氯丙醇的平均回收率在82.4%～103.0%范圍內，RSD在1.25%～5.65%。說明該方法應用于液體調味料中4種氯丙醇的檢測時，回收率及相對標準偏差均在合理范圍，方法的穩定性良好，是一種科學、有效、準確的檢驗方法，可以作為同類食品檢測氯丙醇含量的參考。

2.7 實際樣品測定

隨機在市場購買醬油、魚露、水解植物蛋白液各10份樣品，經處理后采用1.3.3條件進行檢測，結果表明所有樣品均未檢出氯丙醇。

3 結論

采用商品化大孔硅藻土柱凈化，結合氣相色譜-質譜聯用法檢測，建立了一種前處理簡單快捷的液體調味料中氯丙醇含量測定方法。該方法測定液體調味料中3-MCPD、2-MCPD、1,3-DCP和2,3-DCP的檢出限分別為2.0 μg/kg、2.0 μg/kg、5.0 μg/kg、5.0 μg/kg，定量限分別為5.0 μg/kg、5.0μg/kg、10 μg/kg、10 μg/kg。加標回收率為82.4%～107.0%，精密度實驗結果的相對標準偏差為0.85%～8.58%。方法驗證實驗結果表明，該方法重復性好、準確度高，可以為市場監管和檢驗檢測提供技術保障。