UPLC-MS/MS法測定牛奶和豆乳中百草枯和敵草快的殘留量

莫 楠，張立佳，劉麗君，高玉杰，謝瑞龍，呂志勇，李翠枝

（內蒙古伊利實業集團股份有限公司，內蒙古 呼和浩特 010110）

百草枯和敵草快均為聯吡啶類季銨鹽[1]，是一種速效接觸型滅生性除草劑，與土壤接觸會迅速鈍化，對根莖類作物無效[2]。百草枯和敵草快極易溶于水，在酸性溶液和中性溶液中穩定，在堿性溶液中易分解[3]。百草枯和敵草快具有很強毒性，其中尤以百草枯毒性最強，且尚無特效治療方法[4-5]。百草枯和敵草快的廣泛使用使其在動物性食品中再殘留概率大大增加，我國標準GB 2763—2021《食品中農藥最大殘留限量》中規定，生乳中百草枯限量值為0.005 mg/kg，敵草快限量值為0.01 mg/kg。長期食用帶有毒性殘留物的食品對人體健康極易產生不良影響，因此，建立準確高效的檢測方法尤為重要。

目前，對于百草枯和敵草快的檢測方法主要有液相色譜法[6-8]、氣相色譜-質譜法[9-10]、液相色譜-質譜聯用法[11-12]、氣相色譜法[13-14]。其中氣相色譜法、氣相色譜-質譜法檢測最為普遍，但兩種檢測方法都存在百草枯沸點偏高而難以裂解和氣化的缺點，同時前處理操作過于繁瑣[15]。液相色譜法目前主要有反向色譜法和依托于親水作用色譜柱法，這一方法優點在于可以實現堿性化合物的保留，同時又無需加入離子對試劑，但此方法也存在定性能力差、靈敏度偏低等缺點[16]。而液相色譜-質譜聯用法具有選擇性好、背景干擾少、靈敏度高等特點，作為確證方法最為合適[17-18]。

已報道的標準方法和文獻中，牛奶中敵草快和百草枯單獨測定或同時測定的極為少見。目前已報道的研究中多以糧谷、果蔬、水和生物樣本為主，提取條件復雜且效率不高[19-21]。已有文獻中，絕大多數采用純有機試劑或酸化有機試劑來進行樣品提取，這樣的提取方法并不適用于牛奶和豆乳這類液體樣品中百草枯和敵草快的提取，同時，凈化條件也大多選用固相萃取小柱或固相填料進行樣品凈化，但這兩種凈化方式會對牛奶和豆乳中的目標物產生吸附作用，嚴重影響回收率[22-24]。本研究提出了先對樣品進行酸化，使用甲醇沉淀蛋白，再加入正己烷除去脂類的方法，去除掉繁瑣的凈化方法，方便高效地改善了目標物的提取效率。本研究旨在開發一種簡便、高效、準確測定牛奶和豆乳中百草枯和敵草快殘留量的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，對保障食品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

敵草快二溴鹽標準物質（C12H12Br2N2）（純度≥99.0%）、百草枯二氯鹽標準物質（C12H14Cl2N2）（純度≥99.0%）、敵草快-d4（C12H8D4Br2N2）（純度≥99.0%）、百草枯-d8（C12H6CL2N2D8）（純度≥99.0%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；Milli-Q超純水、乙腈（質譜純）：德國Merck公司；甲醇（色譜純）：科隆化學品有限公司；甲酸（質譜純）：天津市沃爾孚科技發展有限公司；甲酸銨（色譜純）：上海安譜實驗科技股份有限公司；WCX（3 mL，60 mg）固相萃取柱、HLB（3 mL，60 mg）固相萃取柱、C18（3 mL，60 mg）固相萃取柱、EMR-Lipid（3 mL，300 mg）固相萃取柱、PRIME HLB（3 mL，60 mg）固相萃取柱：美國Waters公司；牛奶、豆乳：市售。

1.2 儀器與設備

Thermo Biofuge Stratos低溫高速離心機：美國Thermo公司；Waters TQ-S超高效液相色譜-串聯質譜（ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）（配備電噴霧離子源）：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品提取方式

方式①：稱取5 g（精確到0.01 g）均勻試樣（牛奶、豆乳），置于50 mL具塞離心管中，加入混合同位素標準工作溶液（1 μg/mL）75 μL，混合均勻，并加入50 μL甲酸混勻后超聲20 min，渦旋震蕩5 min。加入10 mL甲醇渦旋振蕩5 min后，15 000 r/min條件下4 ℃離心10 min待凈化。

方式②、方式③：分別按照參考文獻[25-26]中的提取方法。

1.3.2 樣品凈化

將待凈化液通過固相萃取小柱及正己烷凈化（取1.2 mL上清液于塑料離心管中，加入0.3 mL正己烷，渦旋30 s，4 ℃、23 000 r/min離心10 min，吸取適量下層清液，0.22 μm微孔濾膜過濾），接取固相萃取小柱流出液，選擇WCX、HLB、C18、EMR-Lipid、PRIME HLB柱以及正己烷進行凈化試驗，考察在不同的凈化方式對目標產物平均回收率的影響。

1.3.3 色譜條件

Acquity UPLC BEH HILIC色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：35 ℃；進樣量：2 μL；流動相：A為150 mmol/L甲酸銨溶液，B為乙腈；流速：300 μL/min；洗脫條件：0～3 min，40%A。

1.3.4 質譜條件

電離模式：電噴霧正離子模式；毛細管電壓：0.9 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/Hr；碰撞室氣流量：0.18 mL/min；多反應監測模式檢測，其他質譜條件見表1。

表1 百草枯和敵草快檢測的質譜條件Table 1 Mass spectrum conditions for paraquat and diquat determination

1.3.5 標準曲線的繪制

按所需上機濃度準確吸取混合標準溶液和混合內標標準溶液，用空白基質溶液稀釋，配制標準工作溶液，繪制標準工作曲線。

1.3.6 定性定量方法

定性：根據保留時間和離子的相對豐度定性。

定量：采用內標法定量。

1.3.7 基質效應分析

基質標準曲線的繪制：選擇5份空白樣品，采用本實驗的前處理條件對樣品進行提取、凈化后，制備空白基質溶液。精密量取百草枯和敵草快混合標準工作溶液至不同的進樣小瓶中，分別用空白基質溶液稀釋，配制成質量濃度依次為0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL的系列標準工作液，采用UPLC-MS/MS測定，以響應值（Y）為縱坐標，以質量濃度（X）為橫坐標繪制基質標準曲線。

溶劑標準曲線的繪制：精密量取百草枯和敵草快混合標準工作溶液至不同的進樣小瓶中，分別用甲醇-1%甲酸水溶液（2∶1，V∶V）稀釋，配制成質量濃度依次為0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL的系列標準工作液，采用UPLC-MS/MS測定，以響應值（y）為縱坐標，以質量濃度（x）為橫坐標繪制溶劑標準曲線。

根據兩種標準曲線，計算基質效應[27-28]，其計算公式如下：

1.3.8 百草枯和敵草快含量的測定

待測樣品中百草枯和敵草快的殘留量按式（1）計算：

式中：X為待測樣品中目標物殘留量，mg/kg；C為待測樣品中目標物上機質量濃度，ng/mL；V為樣液定容體積，mL；n為稀釋倍數；m為待測樣品質量，g。

1.3.9 數據分析

使用waters MassLynx v4.1軟件對數據進行數據采集，采用Origin 8.0繪圖，采用Microsoft Excel 2016軟件對數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 樣品提取方式選擇

百草枯和敵草快極易溶于水，在酸性溶液和中性溶液中穩定，在堿性的溶液中不穩定，易分解。所以在前處理過程中選擇在酸性條件下進行提取。依據國家標準[29]，采用95%乙醇溶液進行提取，并不適用于牛奶和豆乳基質，凈化程度和提取效率無法滿足檢測需求，故重新對提取溶液進行了選擇。在相同稱樣量的條件下，分別使用該實驗方式（方式①）；甲醇-0.1 mol/L鹽酸溶液（1∶9，V/V）[26]（方式②）和甲酸-乙腈-水（5∶25∶70，V/V）[25]（方式③）作為提取溶液進行相同濃度添加回收實驗對比，比對結果采用外標法進行回收率計算，結果見圖1。

圖1 不同提取方式對2種農藥回收率的影響Fig.1 Effects of different extraction methods on recovery rates of two kinds of pesticides

由圖1可知，采用甲醇-0.1 mol/L鹽酸溶液和甲酸-乙腈-水溶液提取百草枯回收率均低于30%。百草枯和敵草快以離子的形式存在于水中，在pH＜7的溶液中比較穩定，同時酸性條件可以促進百草枯和敵草快的離子化，使其更容易由樣品中遷移至水中，因此選擇在稱取樣品中加入甲酸混勻后振蕩并超聲進行提取，促進目標物離子化并溶于水中[30]。后加入甲醇，進一步提取目標物和沉淀蛋白，避免因直接加入甲醇，而使樣品蛋白沉淀過快，影響目標物的離子化而導致提取效率降低。本實驗提取方法在保證回收率接近100%的提取效率的同時，又能夠達到很好的沉淀蛋白的效果，適用于對牛奶和豆乳基質的提取處理。

2.2 樣品凈化條件選擇

選擇WCX、HLB、C18、EMR-Lipid、PRIME HLB柱以及正己烷進行同一濃度添加回收實驗，采用本實驗提取條件，上清液通過固相萃取小柱凈化，接取固相萃取小柱流出液，過濾后上機，沒有發現目標物，結果表明目標物已被固相萃取小柱吸附。后對固相萃取小柱進行洗脫，氮吹復溶上機，測定回收率，比對結果采用外標法進行回收率計算，結果見圖2。

圖2 不同凈化方式對2種農藥回收率的影響Fig.2 Effects of different purification methods on recovery rates of two kinds of pesticides

由圖2可知，各固相萃取小柱填料均會對牛奶和豆乳基質中百草枯和敵草快產生吸附，且難以洗脫，絕對回收率均低于30%，正己烷處理條件下回收率高，故選擇不使用固相萃取小柱凈化，而采用正己烷除去脂肪的方式進行凈化。此凈化方式可有效的去除提取液中的弱極性物質，在保證目標物絕對回收率的同時，最大可能的去除提取液中的干擾物，方便經濟高效。

2.3 流動相濃度的選擇

由于百草枯和敵草快的強極性和正電荷，極易吸附在色譜柱上，并且難以洗脫，所以選用甲酸銨緩沖液作為流動相洗脫，甲酸銨可以起到加快出峰的同時增強目標物的儀器響應的作用，而這種影響與甲酸胺溶液濃度有著密切關系，故對甲酸銨的濃度進行優化。百草枯和敵草快均屬于堿性化合物，需要酸性條件對峰型進行優化。以百草枯為例，選擇在pH=3.7條件下，分別對10 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、120 mmol/L、150 mmol/L、160 mmol/L不同濃度甲酸銨緩沖液進行比對，結果見圖3。由圖3可知，在甲酸銨濃度為150 mmol/L和160 mmol/L時，可以得到較優的峰型，而甲酸銨濃度為160 mmol/L和為150 mmol/L時目標物峰型無明顯變化，故最終選擇150 mmol/L甲酸銨水溶液作為流動相。

圖3 不同濃度甲酸銨對百草枯出峰的影響Fig.3 Effect of different concentration of ammonium formate on the peak of paraquat

2.4 進樣小瓶的選擇

因為不同廠家的進樣小瓶生產工藝存在差異，對目標物的影響也會不同，所以選擇不同品牌的進樣小瓶進行比對。使用空白基質溶液配制成相同濃度曲線標點，加入到兩個不同廠家生產的玻璃進樣小瓶中及塑料小瓶中，靜置20 min后進行比對。結果表明，兩種品牌玻璃進樣小瓶中，敵草快和百草枯的濃度均有明顯的下降。因為玻璃進樣瓶內表面的自由離子溶解在樣品溶液中，會暴露出玻璃表面活性位點，而百草枯和敵草快在溶液中均以離子化狀態存在，會與玻璃表面活性位點吸附，導致目標物濃度降低，因此玻璃進樣瓶并不適用于百草枯和敵草快的儲存。又因為塑料進樣小瓶不存在內表面暴露可與目標物結合的的活性位點的問題，不會導致目標物在樣液的儲存過程中產生損失，最終選擇塑料材質進樣瓶供上機檢測使用。

2.5 色譜柱的選擇

選取常用的UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）、UPLC HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）、UPLC BEH HILIC柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱進行比對，結果見圖4。由圖4可知，使用HILIC色譜柱的目標物峰型最為理想，因百草枯和敵草快極性強，在C18和T3色譜柱上難以保留，而目標物在HILIC色譜柱上可以很好的被保留，出峰時間適中，峰型和分離效果明顯優于前兩款色譜柱，因此，最終選定HILIC柱作為分離色譜柱。

圖4 不同色譜柱對百草枯和敵草快出峰的影響Fig.4 Effect of different chromatographic column on the peak of paraquat and diquat

2.6 基質效應實驗

樣品中含有多種物質，如乳糖、無機鹽、磷脂等都可能會對目標物在離子源中的電離產生影響，無論是抑制還是增強目標物的電離，都會對定量目標物的準確性產生影響，所以需要對牛奶和豆乳的基質效應進行考察，以確保檢測方法的準確性。針對不同基質樣品，選取具有代表性的空白基質樣品對基質效應進行了考查。用每種空白基質分別配制標準工作液并繪制工作曲線與前處理的提取溶液體系相近的甲醇-1%甲酸水溶液（2∶1，V/V）溶液配制的相同濃度點采用外標法所繪制的工作曲線相比較，基質抑制效應極其明顯。后使用每種空白基質采用內標法分別配制標準工作液并繪制工作曲線與用甲醇-1%甲酸水溶液（2∶1，V/V）溶液配制的相同濃度點采用內標法所繪制的工作曲線相比較，二者曲線斜率做比值，比值大于100%的存在基質增強作用，小于100%的存在基質抑制作用，不利于目標物電離。牛奶和豆乳的基質效應試驗結果見表2。

表2 各種樣品的基質效應試驗結果Table 2 Results of matrix effects of all samples

由表2可知，兩種基質中百草枯有明顯的基質抑制作用，而敵草快的影響得到了很好的削弱。推測這一現象是因為牛奶和豆乳空白基質對百草枯的外標和內標的離子化影響不一致導致。為避免基質效應對目標物定量的影響，在繪制標準工作曲線時，應選用內標定量和基質曲線相結合的方法進行配制標準工作液，以達到準確定量的目的。

2.7 標準曲線和檢出限

依據優化后方法，對方法線性關系和檢出限進行考察。用空白樣品的提取液配制標準曲線，以響應值（Y）為縱坐標，以質量濃度（X）為橫坐標繪制標準曲線，標準曲線及檢出限見表3。

表3 百草枯及敵草快的標準曲線回歸方程、線性范圍、相關系數、檢出限及定量限Table 3 Standard curve regression equation,linear range,correlation coefficient,limits of detection and limits of quantitation of paraquat and diquat

由表3可知，百草枯和敵草快在0.5～10 μg/mL質量濃度范圍內，相關系數R均＞0.99，線性關系良好。以目標峰等于3倍基線噪音為檢出限，目標峰等于10倍基線噪音為定量限進行計算，百草枯和敵草快的檢出限均為0.001 5 mg/kg，定量限均為0.002 5 mg/kg。

2.8 方法回收率和精密度

從每類樣品中選取具有代表性的空白基質樣品進行回收率試驗，采用空白基質標準曲線，內標法定量，本研究百草枯和敵草快加標量分別為0.002 5 mg/kg、0.005 mg/kg、0.025 0 mg/kg，分別計算精密度試驗結果相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果見表4。

表4 方法回收率與精密度試驗結果Table 4 Results of recovery rates and precision tests of the method

由表4可知，不同加標水平百草枯和敵草快的平均回收率范圍在74.8%～115.6%之間；精密度試驗結果相對標準偏差（RSD）的范圍在2.8%～7.7%之間，兩種基質測定結果的RSD均＜10%，滿足國標對檢測方法回收率和精密度的要求，表明本方法具有良好的準確度和精密度。

3 結論

本研究建立了一種可同時提取牛奶和豆乳中百草枯和敵草快的方法。本方法快速高效，在樣品中加入甲酸，使樣品酸化，再加入甲醇沉淀蛋白，達到充分提取目標物的目的。當百草枯和敵草快的添加量為0.002 5～0.025 mg/kg時，其準確度和精密度均符合國標要求。在保證檢測方法可靠性的同時，也為牛奶和豆乳中農藥殘留檢測提供了一種新的思路。