兩種不同過濾方法對去白細(xì)胞混合濃縮血小板的影響分析

陳玉燕 陳惠民 連曉征

血小板由巨核細(xì)胞產(chǎn)生，其主要功能是參與人體的正常止血過程。當(dāng)人體的器官或組織受損時，血小板首先分泌出具有收縮血管功能的物質(zhì)，如：5-羥色胺、兒茶酚胺等，可加速血管收縮，第二是使血小板在損傷部位凝聚，從而產(chǎn)生血小板血栓，達(dá)到一定的止血效果。血小板可啟動凝血機制，將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，最后可形成纖維化的網(wǎng)絡(luò)，加強血小板血栓。此外，血小板還能為毛細(xì)血管提供營養(yǎng)和支持，保持管壁的完整，血液中的血小板結(jié)構(gòu)和功能被破壞會引起機體出血，主要表現(xiàn)為皮膚黏膜的出血，包括牙齦出血、鼻出血、皮膚出血點，嚴(yán)重者可出現(xiàn)顱內(nèi)出血。骨髓造血功能衰竭性疾病引起的血小板數(shù)量嚴(yán)重減少，如再生障礙性貧血，并且有明顯出血癥狀時，就需要輸注血小板治療。血液系統(tǒng)惡性腫瘤化療后，血小板數(shù)量嚴(yán)重減少，如低于2萬/mL，也需要輸注血小板。彌散性血管內(nèi)凝血時，由于血小板消耗性減少，如果血小板低于2萬/mL，也需要輸血小板治療。長期以來，血小板在血液疾病和癌癥患者中扮演著非常關(guān)鍵的角色。當(dāng)前，可采用的機采血小板具有高純度、低白細(xì)胞和低需供體，方便進(jìn)行血小板配型等優(yōu)勢，每年的用量都在增長。血小板制品分單采血小板和濃縮血小板2種。其中，單采血小板因其濃度高、療效好等優(yōu)點在臨床應(yīng)用日趨廣泛。近年來臨床成分血的推廣及全民醫(yī)保政策的落實，血小板（platelet）的臨床用量越來越大，但由于捐獻(xiàn)單采血小板獻(xiàn)血者含量必須符合標(biāo)準(zhǔn)，且單采血小板的采集時間長，不易被獻(xiàn)血者接受，且受到相對有限的獻(xiàn)血者獻(xiàn)血頻次與獻(xiàn)血熱情的影響，導(dǎo)致在單采血小板采集中存在較大困難，已越來越不能滿足臨床需求。同時隨著血液分離技術(shù)的不斷發(fā)展和過濾技術(shù)的不斷完善，手工血小板因其顯著的優(yōu)勢在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛。而單采血小板越來越無法滿足臨床需求[1-2]。手工制備的濃縮血小板作為單采血小板的補充，在臨床應(yīng)用上發(fā)揮了重要作用[3]，現(xiàn)階段去除混合濃縮血小板中白細(xì)胞（white blood cell，WBC）的方法主要有白膜法分離血小板混合過濾法和血小板混合過濾法，這兩種方法在去除WBC過程也會對血小板計數(shù)（platelet count，PLT）產(chǎn)生損耗，為探討這兩種方法對所制備的去白細(xì)胞混合濃縮血小板中WBC和PLT含量的影響，尋找一種比較合適的去白細(xì)胞方法，特對泉州市中心血站2021年6—12月用上面兩種去白細(xì)胞方法制備的80袋去白細(xì)胞混合濃縮血小板中WBC和PLT含量計數(shù)分析，現(xiàn)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇2021年6—12月泉州市中心血站符合文獻(xiàn)[4]要求的獻(xiàn)血者所獻(xiàn)全血400 mL，只有血液采集流暢性及采集完成時間符合文獻(xiàn)[5]要求，該袋血液采用白膜法手工分離制備成濃縮血小板[6]。每天對符合要求可生產(chǎn)成濃縮血小板的400 mL全血血袋按1、2、3等順序編號，編號是奇數(shù)血液生產(chǎn)的濃縮血小板用白膜法分離血小板混合過濾法去除WBC，編號是偶數(shù)血液生產(chǎn)的濃縮血小板用血小板混合過濾法去除WBC。本研究通過了單位倫理委員會審查，并且獲得患者知情同意。

1.2 方法

400 mL血液采集完成后立即放入電子生物冷鏈運輸箱（上海向成生物科技有限公司XC-XXB35L）（22±2）℃保存不超過6 h，將（22±2）℃保存血液用Heraeus6000i離心機（美國ThermoFisher Scientific公司）離心15 min[1 160 g，（22±2℃）]，離心好的血液安放于Sepamatic-SL（Ⅲ）全自動全血成份血分離機（德國LMB公司）分離得到約90 mL白膜層與血漿混合液。依據(jù)文獻(xiàn)參數(shù)[7]，將這些白膜層與血漿混合液放在離心杯內(nèi)，于Heraeus6000i離心機內(nèi)（22±2）℃靜置2 h后再做下述操作。

1.2.1 白膜法分離血小板混合過濾法

將編號為偶數(shù)且ABO血型相同，傳染病檢測結(jié)果為陰性每6袋血液所制備的白膜層與血漿混合液輕輕混勻后于無菌接管機（902880/compodock），將這6袋白膜層與血漿混合液匯聚成1袋，再與混合濃縮血小板專用去白細(xì)胞濾器（南京雙威生物醫(yī)學(xué)科技有限公司）相聯(lián)接進(jìn)行過濾去除WBC后于Heraeus6000i離心機（22±2）℃離心10 min[215 g，（22±2℃）]制成1袋去白細(xì)胞混合濃縮血小板，共制備40袋。

1.2.2 血小板混合過濾法

編號為奇數(shù)的400 mL血液所制備的白膜層與血漿混合液輕輕混勻后于Heraeus6000i離心機（22±2）℃離心10 min（215 g，22±2℃）制成濃縮血小板約60 mL，將ABO血型相同，傳染病檢測結(jié)果為陰性每6袋濃縮血小板于無菌接管機（902880/compodock）匯聚成一袋，再與混合濃縮血小板專用去白細(xì)胞濾器（南京雙威生物醫(yī)學(xué)科技有限公司）相聯(lián)接進(jìn)行過濾去除WBC制備成1袋去白細(xì)胞混合濃縮血小板，共制40袋。

1.3 白細(xì)胞和血小板含量計數(shù)法

將制備好的去白細(xì)胞混合濃縮血小板放置在美國Helmer血小板振蕩保存儀內(nèi)保存24 h后從交叉血辮內(nèi)留取樣本約1 mL到試管中作待測樣本，從待測樣本吸取50 μL加入到另一試管中，再加入450 μL結(jié)晶紫染液（北京瑞爾達(dá)生物科技有限公司）染色10 min后在大容量Nageotte計數(shù)板上于顯微鏡上進(jìn)行殘留WBC計數(shù)，剩下樣本用Sysmex-XT1800iV全自動血細(xì)胞計數(shù)儀測量血小板含量血小板計數(shù)。按文獻(xiàn)[8]標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)殘留WBC計數(shù)小于5.0×106個/袋，即WBC計數(shù)合格，PLT計數(shù)大于等于2.5×1011個/袋，即PLT計數(shù)合格。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩種不同去白細(xì)胞過濾方法制備混合濃縮血小板的WBC和PLT含量

兩種不同去白細(xì)胞過濾方法制備混合濃縮血小板對WBC和PLT含量影響見表1。40袋白膜法分離血小板混合過濾法和40袋血小板混合過濾法去除WBC，其殘余WBC平均值分別為（4.01±1.33）×105/袋和（1.63±0.91）×105/袋，前者WBC殘余值是后者的2倍多，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.34，P＜0.05）。兩種過濾去WBC方法的PLT含量平均值分別為（3.47±1.49）×1011/袋和（2.94±1.03）×1011/袋，白膜法分離血小板混合過濾法PLT含量較高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.85，P＞ 0.05）。

表1 兩種不同去白細(xì)胞過濾方法制備混合濃縮血小板的WBC和PLT含量（個/袋，）

表1 兩種不同去白細(xì)胞過濾方法制備混合濃縮血小板的WBC和PLT含量（個/袋，）

過濾方法 袋 WBC含量 PLT含量白膜法分離血小板混合過濾法 40 （4.01±1.33）×105 （3.47±1.49）×1011血小板混合過濾法 40 （1.63±0.91）×105 （2.94±1.03）×1011 t值 - 9.34 1.85 P值 - ＜ 0.01 0.07

2.2 兩種不同去白細(xì)胞過濾方法制備混合濃縮血小板對WBC和PLT計數(shù)合格情況

兩種不同去白細(xì)胞過濾方法制備混合濃縮血小板對WBC和PLT計數(shù)合格情況影響見表2。白膜法分離血小板混合過濾法去白細(xì)胞后WBC殘余合格率分別為80.0%，而血小板混合過濾法去白細(xì)胞后WBC殘余合格率97.5%，合格率明顯較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩種去白細(xì)胞方法的PLT含量合格率分別為85.0%和75.0%，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 兩種不同去白細(xì)胞過濾方法制備混合濃縮血小板對WBC和PLT計數(shù)合格情況比較[袋（%）]

3 討論

隨著輸血技術(shù)的發(fā)展，成分輸血的優(yōu)勢日益得到認(rèn)可，一袋血液可以分離多種血液成分，并根據(jù)其不同血液成分的保存條件進(jìn)行儲存，不僅可以最大限度地保存每個血液成分的有效性，滿足患者各種需求，還可以節(jié)約血液資源，同時在保存懸浮紅細(xì)胞的過程中，它還能減少白細(xì)胞—血小板微聚物的形成，降低受血者發(fā)生血管栓塞的風(fēng)險，并減少非溶血性輸血反應(yīng)的發(fā)生。其中血小板輸注是治療多種原因引起的血小板減少癥（綜合征）、提高患者血小板數(shù)量的有效手段和措施，使得臨床的血小板消耗量日益增加，供不應(yīng)求。目前國內(nèi)血站供應(yīng)臨床的血小板制劑包括有機采血小板和手工血小板，前者從單個無償獻(xiàn)血者采集（制備），其來源相對困難；后者1個治療量從多名獻(xiàn)血者捐獻(xiàn)的全血中分離出來，以制備多個小袋，可供多位臨床患者（尤其是嬰幼患兒）使用[9]，可有效地節(jié)省寶貴的血液資源。在美歐和其他發(fā)達(dá)國家，手工血小板的臨床應(yīng)用始終占血小板用量的一半以上。相反，一方面在中國臨床，機采血小板用量占據(jù)絕對主導(dǎo)地位，但卻越來越難以滿足逐年增長的需求，另一方面手工血小板的臨床用量（比例）仍在繼續(xù)被人為壓低，使得血站從獻(xiàn)血者全血分離血小板的浪費（丟棄）日益增加。實際上，盡管普遍認(rèn)為機采血小板質(zhì)量優(yōu)于手工血小板，特別是具有高純（濃）度、單一供體的優(yōu)點，但固有的缺點也不可忽視：由于與一次性塑料血小板分離管道剪切循環(huán)，機采血小板體外活化度高于手工血小板，并且在輸入患者體內(nèi)后，它不能更好地發(fā)揮功能[10]。

目前，我國幾乎所有臨床用成分血都存在供應(yīng)短缺的問題，其中尤以血小板的缺口最大——因儲存期短、儲存條件較苛刻，以及“互助獻(xiàn)血”的叫停等造成。各地用血醫(yī)院如果能夠充分利用血站從無償獻(xiàn)血者全血中分離制備的手工血小板，不但可以節(jié)約和充分利用寶貴的血液資源（到目前為止，作為從全血中提取紅細(xì)胞的“副產(chǎn)品”，手工血小板不能用于臨床便多半都被丟棄），更重要的是緩解目前臨床血小板的供需矛盾，治療更多的患者。

臨床上很多疾病要輸注血小板，血小板制劑中含有大量WBC，并且證實大部分屬于淋巴細(xì)胞，因此如果反復(fù)輸注非去白細(xì)胞血小板，較易產(chǎn)生人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）抗體，有30%～70%的患者會發(fā)生同種免疫反應(yīng)，導(dǎo)致血小板輸注后治療效果極差[11]。單采血小板的采集時間長，采集過程要輸入一定劑量的抗凝藥物和生理鹽水，且采集后獻(xiàn)血者的活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）時間變長，血液中Ⅷ因子及血纖維蛋白（Fibrin，F(xiàn)Ib）含量下降等因素，影響單采血小板的采集[12]。

依據(jù)原國家衛(wèi)生計生委（中華人民共和國衛(wèi)生健康委員會官網(wǎng)）文件關(guān)于提高手工分離血小板利用率的要求[13]。手工分離濃縮血小板成為臨床供應(yīng)重要力量。但白膜法手工制備的濃縮血小板含有大量WBC，且一袋濃縮血小板的血小板數(shù)量無法滿足臨床治療需要，因此需要將多袋濃縮血小板混合制備成混合濃縮血小板并盡可能去除WBC來滿足臨床之需。混合濃縮血小板在去WBC過濾時除了去除WBC外還會對PLT造成損耗，如何在這兩個指標(biāo)尋找平衡？本研究中40袋白膜法分離血小板混合過濾法和40袋血小板混合過濾法去除WBC，其殘余WBC 平均值分別為（4.01±1.33）×105/袋和（1.63±0.91）×105/袋，前者WBC殘余值是后者的2倍多，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.34，P＜0.05），說明白膜法分離血小板混合過濾法WBC殘余量較多。兩種過濾去WBC方法的PLT含量平均值分別為（3.47±1.49）×1011/袋和（2.94±1.03）×1011/袋，白膜法分離血小板混合過濾法PLT含理較高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.85，P＞0.05）。根據(jù)文獻(xiàn)要求[11]，去白細(xì)胞混合濃縮血小板的WBC和PLT計數(shù)需符合文獻(xiàn)要求才算合格，兩種過濾方法去白細(xì)胞后WBC合格率分別為80.0%和97.5%，血小板混合過濾法WBC合格率97.5%，合格率明顯較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩種去白細(xì)胞方法的PLT含量合格率分別為85.0%和75.0%，雖然白膜法分離血小板混合過濾法的合格率為85.0%，比較高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

綜上所述，白膜法分離血小板混合過濾法和血小板混合過濾法去除混合濃縮血小板中WBC，血小板混合過濾法去除WBC效果較好且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），雖然在去除WBC中也損失一定量PLT，但比較好地平衡在去除白細(xì)胞和保留血小板更適用于臨床用血[3，14]，因此建議采用血小板混合過濾法去除混合濃縮血小板WBC。