血漿miR-138水平與冠心病的關系及對HepG2細胞Sirt1基因的影響

李斯 尹明潔 米穎　孫雅楠

【摘要】? 目的? 探討血漿miR-138水平與冠心病（coronary heart disease，CHD）的關系及對HepG2細胞沉默信息調節因子（sirtuin type 1，Sirt1）基因mRNA表達的影響，評價血漿miR-138應用于CHD臨床診斷的價值。方法? 選取2018年1月- 2020年1月在醫院診斷CHD并完成冠狀動脈造影的患者30例為病例組（CHD組）及健康人員28例為對照組。檢測兩組血漿miR-138的水平及HepG2細胞Sirt1基因mRNA表達水平；通過單因素分析及多因素Logistic回歸分析血漿miR-138的水平與CHD的關系，并通過ROC曲線評估血漿miR-138的水平對CHD的診斷價值。結果? 單因素分析顯示，CHD組血漿miR-138的水平顯著低于對照組，差異有統計學意義（P<0.01）；多因素Logistic回歸分析顯示，血漿miR-138的水平降低，發生CHD的危險性增加（P<0.05）。ROC曲線下面積AUC=0.768（95%CI：0.626～0.909），臨界值=0.00162，此時血漿miR-138診斷CHD的靈敏度=73.333%，特異度=100.000%，Kappa=0.726，具有臨床應用價值。miR-138轉染組Sirt1 mRNA水平顯著低于對照組，組間差異有統計學意義（P<0.005）。結論? 血漿中miR-138的表達水平與CHD有關聯，血漿中miR-138的表達水平降低，CHD的風險增大，在對CHD的診斷中有一定價值。轉染miR-138能夠抑制HepG2細胞mRNA表達。

【關鍵詞】? ?miR-138；冠心病；HepG2細胞；Sirt1

中圖分類號? R541.4? ? 文獻標識碼? A? ? 文章編號? 1671-0223（2023）05--04

隨著時代的發展，人們生產生活方式的改變，冠心病（coronary heart disease，CHD）的患病率逐年升高，已經成為威脅人類健康的主要致病因素之一。miR-138是microRNA組成之一，目前報道顯示，其能夠參與血管內皮細胞增生、分化，以及調控細胞的凋亡[1]，表明其在CHD的形成過程中可能存在一定在作用。沉默信息調節因子（sirtuin type 1，Sirt1）是一種組蛋白脫乙酰酶，主要依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸發揮作用，Sirt1 能夠廣泛的存在于機體組織當中，并且參與到機體能量代謝的調整以及細胞周期的調整，延緩細胞凋亡，延緩細胞衰老 [2]。血漿miR-138水平與CHD的關系尚未見報道，并且miR-138是否對HepG2細胞Sirt1基因產生影響仍不明確。本研究檢驗CHD患者血漿中miR-138表達變化情況，在HepG2細胞中研究miR-138對Sirt1基因的影響，評價血漿miR-138用于CHD臨床診斷的價值。

1? 對象與方法

1.1? 研究對象

選取2018年1月- 2020年1月在醫院診斷CHD并完成冠狀動脈造影的患者30例為病例組（CHD組）。根據年齡及性別等基本資料與CHD組相匹配的原則，同時選擇健康人員28例為對照組。本研究由醫院倫理委員會批準通過，并向所有研究對象進行宣講知情同意，所有研究對象表示同意參與并簽署知情同意。

（1）CHD的診斷及入組標準：依據2011年《USA心臟學會以及UA/非ST段抬高心肌梗死指南》，冠心病患者具備以下特點之一：①患者在既往的病史中已存在心絞痛的癥狀，近期（1個月）內，心絞痛癥狀較前加重或心絞痛癥狀發作頻率增加；②患者的心絞痛癥狀，為近1個月之內新發生的癥狀；③患者如為靜息性心絞痛的發作滿足：患者在休息或者安靜時（非勞累狀態下）發作的心絞痛癥狀；④患者近期（1個月）內心絞痛的癥狀發作的持續時間延長，并經給予含服硝酸酸甘油后效果比較差的。其次對于臨床診斷CHD的患者，需要經冠狀動脈造影檢查，如至少1支冠狀動脈血管的直徑狹窄程度≥50%。

（2）排除標準：①患有存在先天性心臟病或者存在心臟瓣膜病的，已臨床明確診斷的具有嚴重的充血性心衰患者；②患者近3個月內，出現的造成損傷性血管的疾病，近1個月出現急性炎癥感染的疾病等；③患者目前存在肝臟、腎臟及其他臟器的重癥疾病及風濕免疫類或腫瘤類疾病，嚴重的顱內血管病、外周動脈栓塞及閉塞等。

1.2? 實驗室檢驗

1.2.1? 血漿miR-138表達水平檢測

（1）標本采集：空腹8h后，于次日清晨早8h（CHD患者在行冠狀動脈造影之前），行靜脈采血，分離血漿，收集標本。

（2）血漿中總RNA的提取：此部分實驗是應用mirVana Paris Kit試劑盒完成本部分實驗，實驗根據說明書操作，按步驟來提取血漿RNA，將提取總RNA試管放置于-80℃的冰箱內進行凍存保留。

（3）cDNA的合成：應用實時熒光定量PCR技術以Taqman探針法進行，配置RT-PCR反應體系：加入10×緩沖液0.8μl、加入RNA 4.5μl、加入dNTP 0.2μl、加入抑制劑為 0.1μl、加入無水的RNase 0.4μl、加入RNA引物1.5μl、加入RTase 0.5μl，總體系為8μl，經充分混勻后離心，反應體系配置過程均在冰板上進行。反應條件設置為：16℃ 60min、42℃ 60min、85℃ 5min、4℃forever。

（4）qRT-PCR：體系配置：吸取所需物質配置反應體系，加入2× TaqMAN universal PCR Master混合物為10μl、加入無水RNase 5μl、加入TaqMAN 探針1μl、加入cDNA為 4μl，反應體系總量為20μl，搖勻后離心。反應條件為：模板預變性時間為95℃經10 min，中模板變性時間95℃經15s、60℃經60s后進行退火，共40循環；本部分試驗樣本均做副管，實驗重復做3次，仔細記錄每一次實驗的CT值結果，經計算取平均值錄入數據，后期經2-?CT轉換，進行統計。

1.2.2? HepG2細胞Sirt1mRNA水平檢測

（1）HepG2細胞經傳代培養后進行轉染實驗：將HepG2細胞用PBS洗2次，將配制好的miR-138轉染復合物，分別加入到6孔板中，加入Opti-MEM培養基750μl/孔，混合均勻，于 37℃、5.0﹪CO2、飽和濕度條件的培養箱中培養24h。

（2）細胞qRT-PCR：①細胞總RNA的提取：轉染實驗結束后輕柔剝離細胞，使細胞脫落并進一步應用裂解液裂解，吸取上清液，加入等體積的異丙醇加入離心管，留取試管底部會白色沉淀物，吸取75%的乙醇1ml緩慢沿管壁加入離心管，離心后棄去。于室溫下干燥5min，使乙醇完全揮發，加入70～80μl 焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水溶解沉淀，待miRNA沉淀完全溶解后，-80℃冰箱保存。②細胞mRNA qRT-PCR：

引物序列Sirt1：5' CTACTGGTCTTACT TTGAGGG3'（上游）；

5'CAAGGGATGGTATTTATGCT3'（下游）

β-actin：5'ACAGAGCCTCGCCTTTGC3'（上游）

5'CCACCATCACGCCCTGG3'（下游）

以β-actin作為內參，配置每個反應體系：2×One Step SYBR?RT-PCR Buffer 4 10μl、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 1.0μl、PCR Forward Primer（10μM）1.0μl、PCR Reverse Primer（10μM） 1.0μl、總RNA4.0μl、RNase Free H2O 3μl，總反應體系共20μl。反轉錄條件：42℃30min、95℃10min 1個循環，PCR反應條件：95℃10s、60℃60s 40循環。實驗結束后記錄反應的Ct值，進行實驗統計。

1.3? 數據處理方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。計數資料計算百分率（%），率的比較采用卡方檢驗；正態分布的計量資料使用“±s”表示，采用獨立樣本檢驗；非正態分布的計量資料用“M（P25，P75）”來表示，組間中位數比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2? 結果

2.1? 兩組人員臨床特征比較

CHD組BMI水平、吸煙比例顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.001）；兩組性別、年齡、空腹血糖（FPG）、血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.2? 血漿miR138表達水平與冠心病的關系

2.2.1? 單因素分析? CHD組與對照組血漿miR138表達水平比較結果顯示，CHD組血漿miR-138的表達水平顯著低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），表明血漿miR-138的表達水平與冠心病有關聯，見表2。

2.2.2? 多因素分析? 以是否冠心病患者為因變量（是=1，否=0），以表1中有統計意義的因素及血漿miR-138表達水平為自變量，進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，在控制了其他因素影響后，血漿miR-138表達水平仍然與冠心病有關系（P<0.05），血漿miR-138表達水平降低，冠心病發病風險增加，見表3。

2.3? 血漿miR-138水平對CHD診斷價值

ROC曲線結果顯示，AUC=0.768（95%CI：0.626～0.909），說明血漿miR-124水平對于CHD具有一定的區分度，根據約登指數篩選的診斷臨界值為0.00162，見圖1。以血漿miR-138表達水平<0.00162為診斷CHD的標準，診斷結果見表4。結果顯示，血漿miR-138診斷CHD靈敏度73.333%，特異度100.000%，具有較高的真實性，并且Kappa值為0.726，診斷結果與實際結果高度一致，具有臨床應用價值，見表4。

3? 討論

CHD是威脅人類健康的首要治病因素，是心肌梗死、心源性猝死的前期病癥，但是CHD的診斷仍依據患者的臨床癥狀，心電圖甚至是冠狀動脈造影檢查術，目前仍缺乏對于CHD精準診斷的簡便方法。miRNA是一類非編碼的小RNA分子，它在多種生物學功能發揮調節作用，對靶基因表達方面發揮抑制mRNA翻譯或促進mRNA降解的負性調節因子[3]。miRNA在人體生理以及病理過程中發揮一定作用，其中miR-138報道與心血管內皮細胞遷移、增殖及細胞周期代謝相關[2]，但是miR-138表達水平是否在CHD患者發生變化目前尚未見報道。

關于miR-138的功能研究顯示，高表達miR-138能夠顯著抑制血管內皮祖細胞的遷移及血管生成作用，應用白藜蘆醇后能夠顯著抑制miR-138的表達水平，并且改變其對內皮祖細胞的作用，改變血管生成及遷移，改變血栓的機化再通作用[4]。還有研究提示GECs細胞中miR-138處于中低表達水平，過量表達miR-138能夠抑制膠質瘤的血管新生過程，研究中還證實miR-138能夠負性調控SOX13因子的表達發揮抑制膠質瘤血管的新生，抑制腫瘤的遷移及轉移，在控制腫瘤轉移中發揮重要作用[5]。還有學者研究表明，miR-138的上調通過下調Lcn2的促凋亡基因表達來抑制缺氧誘導的心肌細胞凋亡[6]。基于miR-138在心血管細胞調節中的作用，此次研究顯示在CHD患者血漿中miR-138水平顯著低于正常對照組，在CHD發病過程中與miR-138過渡消耗可能相關。

目前有報道顯示miR-138具有參與細胞凋亡及調整細胞周期的作用。學者建立了人臍靜脈內皮細胞的衰老模型，因為人臍靜脈內皮細胞的增殖能力會伴隨培養時間的延長而逐漸下降。在實驗中，研究者發現miR-138能夠穩定表達，表達水平與培養時間正相關，并且通過細胞凋亡及增殖實驗發現其具有促進凋亡作用[7]，發現miR-138能夠通過縮短細胞周期，發揮通過促進細胞衰老的作用抑制內皮細胞的增殖[8]。在細胞凋亡過程中，Sirt1起到重要作用，具有維持基因組的穩定性，延長細胞壽命，以及在調整細胞周期中起到重要作用[9]，其機制可能通過內皮型一氧化氮合酶等因子的靶基因作用，延緩細胞衰老等、促進細胞功能的作用[10]。研究顯示miR-138可能對Sirt1基因表達產生影響，如大鼠缺氧心肌細胞中證實，Sirt1的轉染可以產生對缺氧心肌細胞的保護作用，miR-138能夠抑制Sirt1基因的表達，調節缺氧心肌細胞的凋亡，而miR-138抑制劑轉染后能夠減少缺血缺氧心肌細胞的凋亡[11]。然而在miR-138是否對Sirt1因子mRNA水平發揮調節作用，是否對Sirt的蛋白轉錄過程起關鍵作用，目前未見報道。本次研究顯示，轉染miR-138能夠顯著抑制HepG2細胞mRNA表達，但在轉錄后翻譯過程中是否發揮作用需進一步研究證實。

綜合以上，CHD患者血漿中miR-138表達水平降低，可能是由于其在CHD發生發展中存在過度消耗，miR-138能夠抑制HepG2細胞Sirt1基因mRNA的表達，但其是否對Sirt1蛋白表達產生影響，有待于之后的研究進一步證實。

4? 參考文獻

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[2023-01-09收稿]