粘毛黃芩質量標準提高研究

孫倩男 張建平 渠曉艷 塔 娜 高 寒 郭寶鳳

內蒙古自治區藥品檢驗研究院中蒙藥標準研究實驗室，內蒙古呼和浩特 010020

粘毛黃芩系唇形科黃芩屬植物粘毛黃芩的干燥根，別名腺毛黃芩、黃花黃芩，具有清熱降火、瀉肝利膽、明目的功效[1]，主產于山西北部、內蒙古、河北北部及山東（煙臺）尤以在內蒙古境內分布廣泛，野生資源儲量大[2-3]。粘毛黃芩因其資源豐富、質量較好而成為最具有利用價值的地方品種之一，一些地區還將其作為黃芩的代用品使用[4]。此外，粘毛黃芩作為一種特色蒙藥材，在《蒙藥正典》《晶珠本草》《金光注釋集》等蒙藥相關書籍中均有記載，蒙古名為希日-巴布、希拉渾欽、希拉巴布、希拉巴特爾等[5]。蒙醫臨床所用黃芩的正品即包括粘毛黃芩[6]。粘毛黃芩中主要含有黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、粘毛黃芩素Ⅰ、粘毛黃芩素Ⅱ等常見黃酮類成分[5]。近年研究還發現粘毛黃芩中含有酚酸類成分包括阿魏酸、3-甲氧基-4-羥基苯甲酸等；香豆素類成分包括6-甲氧基-7-羥基香豆素、6，7-二羥基香豆素[7]，具有抗菌、抗炎、抗感染[8]、抗癌[9]、神經保護[10]等生物活性。

目前關于粘毛黃芩藥材的質量控制情況：《內蒙古蒙藥材標準》[11]《內蒙古中藥材標準》[1]和《吉林省中藥材地方標準》[12]收載的該藥材的質量標準中僅有性狀和理化鑒別項，檢測指標少且專屬性差。為了提高粘毛黃芩質量控制的水平，本研究參考其他品種質量標準提高的研究內容[13-15]及《中華人民共和國藥典》[16]2020 年版一部黃芩項下的標準規定，擬通過增加顯微鑒別和薄層鑒別項，水分、總灰分及酸不溶性灰分檢查項，浸出物測定及高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定粘毛黃芩藥材中的主要功效成分-黃芩苷和漢黃芩苷的含量，來完善粘毛黃芩藥材的質量控制標準，達到科學、高效、經濟地控制藥材質量、保證用藥安全有效的目的。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

9240A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；MFL-2000 型馬弗爐（天津市華北實驗儀器有限公司）；MSE-6.6S-000-DM 型百萬分之一電子天平、MSA-224S-ICE-DU 型萬分之一天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；LEICA DM3000 型智能型顯微鏡[徠卡顯微鏡（中國）有限公司]；KQ-500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SF-TDL-5A 型低速大容量離心機（上海菲恰爾分析儀器有限公司）；Ultimate 3000 型高效液相色譜儀（戴安中國有限公司）。

1.2 試藥與試劑

黃芩苷對照品購于中國食品藥品檢定研究院（批號：110715-201821）；漢黃芩苷對照品購于中國食品藥品檢定研究院（批號：112002-201702）；漢黃芩素對照品購于中國食品藥品檢定研究院（批號：111514-201706）；黃芩素對照品：中國食品藥品檢定研究院（批號：111595-201607）。薄層板：聚酰胺薄膜（煙臺化學工業研究所）。甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純，水為離子交換高純水。本研究共收集6 批粘毛黃芩藥材樣品，經內蒙古藥品檢驗研究院副主任中藥師郭寶鳳鑒定為粘毛黃芩正品。見表1。

表1 藥材來源

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別

取6 批粘毛黃芩藥材樣品，分別粉碎過篩后，照顯微鑒別法（《中華人民共和國藥典》[16]2020 年版4部通則2001）制片并觀察粉末的顯微特征。本品粉末黃色。木栓細胞多見，棕黃色，表面觀多角形，斷面觀呈柵狀；石細胞黃色或無色，單個散在或成群，長方形、方形、類圓形、纖維狀，長50～160 μm，直徑14～70 μm，壁較厚，壁孔及孔溝明顯，層紋較密；網紋導管多見，直徑約70 μm，另有具緣紋孔導管及梯紋導管；木薄壁細胞梭形，具膈。見圖1。

圖1 粘毛黃芩藥材粉末的顯微特征（400×）

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1 對照品溶液的制備 取黃芩苷對照品、漢黃芩苷對照品、黃芩素對照品、漢黃芩素對照品，加甲醇制成每毫升含1、1、0.5、0.5 mg 的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末1 g，加乙酸乙酯-甲醇（3∶1）的混合溶液30 ml，加熱回流30 min，放冷，濾過，將濾液蒸干，殘渣加5 ml 甲醇使其溶解，取上清液作為供試品溶液。

2.2.3 薄層色譜條件及結果 照薄層色譜法（《中華人民共和國藥典》[16]2020 年版4 部 通則0502）試驗，吸取上述兩種溶液各1 μl，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）為展開劑，聚酰胺薄膜預先置展開缸中飽和30 min，展開，取出，晾干后置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯示4 個相同的暗色斑點。見圖2。

圖2 粘毛黃芩藥材中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的薄層色譜

2.3 水分、總灰分、酸不溶性灰分的測定

取各批次粘毛黃芩藥材粉末約2 g，精密稱定，稀乙醇為提取溶劑。粘毛黃芩藥材的水分參照《中華人民共和國藥典》[16]2020 年版4 部通則0832 第二法測定，總灰分和酸不溶性灰分參照通則2302 測定。浸出物參照通則2201 測定。測定結果及各項目平均值見表2。

表2 粘毛黃芩中水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物測定結果（%）

2.4 粘毛黃芩藥材中黃芩苷、漢黃芩苷的HPLC 含量測定

2.4.1 色譜條件SHMADZUC18色譜柱（250mm×4.6mm，5 μm）；柱溫：30℃；流速：1.0 ml/min；進樣量：10 μl；檢測波長：278 nm；流動相為甲醇-乙腈-1%甲酸水溶液，梯度洗脫。見表3。

表3 梯度洗脫

2.4.2 混合對照品溶液的制備 分別取黃芩苷、漢黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇使溶解并制成質量濃度為42.059 6、19.384 8 μg/ml 的混合對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取1 號樣品中粉約0.25 g，精密稱定后置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇100 ml，密塞后稱定重量，然后超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，取出放冷，再次稱定重量并用70%乙醇補足減失的重量，搖勻濾過后精密量取續濾液5 ml，置于25 ml 量瓶中并加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻濾過后取續濾液，即得。

2.4.4 系統適用性試驗 取“2.4.2”項下混合對照品溶液和“2.4.3”項下供試品溶液按“2.4.1”項下的色譜條件進樣分析，記錄色譜圖（圖3）。結果顯示在此色譜條件下，黃芩苷、漢黃芩苷與其他色譜峰分離度均＞1.5，理論塔板數均在4 000 以上。

圖3 混合對照品、供試品的高效液相色譜圖

2.4.5 線性關系考察 取黃芩苷和漢黃芩苷對照品精密稱定，加甲醇使溶解并稀釋，制成黃芩苷質量濃度分別為8.411 9、21.029 8、42.059 6、63.089 4、84.119 2 μg/ml，漢黃芩苷質量濃度分別為3.876 9、9.692 4、19.384 8、29.077 2、38.769 6 μg/ml 的混合對照品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件分析，分別測定黃芩苷和漢黃芩苷的峰面積，對照品的峰面積值為縱坐標，對照品的進樣量（ng）為橫坐標，進行線性回歸，得到黃芩苷的回歸方程為Y=0.058 9X-0.192 3，r=0.999 9，黃芩苷的進樣量在84.119 2～841.192 8 ng 范圍內與峰面積呈良好的線性關系；漢黃芩苷的回歸方程為Y=0.066 6X+0.060 1，r=1.000 0，漢黃芩苷的進樣量在38.769 6～387.696 0 ng范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.4.6 精密度試驗 精密吸取同一份供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件連續進樣6 次，分別記錄黃芩苷、漢黃芩苷的峰面積。結果顯示其峰面積的RSD 分別為0.96%、1.79%，表明儀器精密度良好。

2.4.7 穩定性考察 精密吸取同一份供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣分析，記錄黃芩苷、漢黃芩苷的峰面積。結果顯示其峰面積的RSD 分別為0.31%、1.20%，表明供試品溶液在24 h 內穩定。

2.4.8 重復性考察 取1 號樣品6 份，精密稱定，按“2.4.3”項下方法制成供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣分析，記錄黃芩苷、漢黃芩苷的峰面積并計算其含量。結果顯示其含量的RSD 分別為0.8%和1.2%。表明該方法重復性良好。

2.4.9 加樣回收率試驗 取已知含量的1 號樣品（黃芩苷含量79.16 mg/g、漢黃芩苷含量22.81 mg/g）6 份，每份約0.12 g，精密稱定，分別置于錐形瓶中，分別精密加入混合對照品溶液（分別取黃芩苷、漢黃芩苷對照品適量，精密稱定，加70%乙醇使溶解并制成質量濃度為0.207 85、0.057 49 mg/ml 的混合對照品溶液）50 ml，再分別精密加入70%乙醇50 ml，余按“2.4.3”項下方法制成供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣分析，記錄黃芩苷、漢黃芩苷的峰面積并分別計算兩成分含量。見表4。

表4 黃芩苷、漢黃芩苷加樣回收率

2.4.10 樣品含量測定 精密稱取6 批粘毛黃芩藥材粉末，按“2.4.3”項下方法制成供試品溶液，每批樣品制備平行樣2 份，按“2.4.1”項下色譜條件進樣分析，記錄黃芩苷、漢黃芩苷的峰面積，分別計算兩成分的含量。見表5。

表5 6 批樣品中黃芩苷、漢黃芩苷的含量（按干燥品計）

3 討論

本研究的顯微鑒別發現，粘毛黃芩中石細胞的鏡檢率較高，多呈單個散在或成群，且在粘毛黃芩粉末中未發現梭形韌皮纖維，而黃芩粉末中石細胞較少，但梭形韌皮纖維檢率較高。上述兩點可以作為黃芩與粘毛黃芩的生藥學鑒別點。

本研究的薄層鑒別方法同時考察黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素4 個指標，可對粘毛黃芩進行快速定性鑒別，檢測更加高效便捷。

本研究采用HPLC，同時測定了粘毛黃芩藥材中黃芩苷、漢黃芩苷的含量，較張金花等[17]只測定粘毛黃芩中黃芩苷含量的方法，能更好地反映及控制粘毛黃芩的質量。耐用性試驗方面，取重復性試驗使用的樣品，采用AgilentZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Alltima HP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），測定粘毛黃芩中黃芩苷、漢黃芩苷的含量，結果一致，RSD 分別為0.77%、1.48%。

近年來隨著中藥現代化高速發展，對黃芩中黃酮類化合物的研究不斷深入，如研究發現漢黃芩苷具有調節促炎因子水平、促進黏膜修復的功效[18]；黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素在黃芩治療腸道疾病的過程中主要發揮抑制炎癥、抑制氧化應激及免疫調節的作用[19]。研究還發現黃芩中的黃酮類化合物還具有抗腫瘤、心血管保護及神經保護和抗高血糖的功效[10,20-24]。以黃芩為主的藥品、保健品不斷涌向市場，也因此黃芩在市場的需求量居高不下。粘毛黃芩與黃芩含有部分相同的活性成分，可考慮作為黃芩的替代品或者活性成分的提取原料，既可緩解黃芩的資源短缺，也可擴大粘毛黃芩的藥用范圍。本研究建立的方法指標選擇適宜，重現性良好，可用于粘毛黃芩的質量控制，為日后粘毛黃芩的開發利用提供理論依據和數據支撐。