新生兒濾紙干血片自動打孔檢測系統檢測葡萄糖-6- 磷酸脫氫酶的性能評價

譚玉華（通信作者），潘曉芳，李高成，余海枷，陳梅欣，譚港澳，梁天鋮，馮健明

1 廣州市豐華生物工程有限公司體外診斷試劑研發中心 （廣東 廣州 510730）；2 廣東省醫療器械質量監督檢驗所綜合檢驗四室 （廣東 廣州 510663）

葡萄糖- 6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency，G6PD）缺乏癥在全世界分布廣泛，致病原因為G6PD 基因突變導致G6PD酶活性缺失。據統計，我國G6PD 缺乏癥分布呈南高北低趨勢，廣東、廣西、海南、云南、貴州等地區人群患病率較高；而隨著人口流動，患病率較低的地區也呈現增高趨勢[1]。我國自1981年開展新生兒遺傳代謝性疾病篩查（簡稱新篩）以來，多省市逐步增加了G6PD 缺乏癥的篩查項目[2]。G6PD 缺乏癥新生兒篩查為檢測干血片的G6PD 酶活性，其篩查方法主要包括熒光定量法和熒光斑點法，其中熒光定量法因具有較高的特異度與靈敏度，而成為G6PD 缺乏癥新生兒篩查的推薦方法。目前，新篩是通過實驗室方法檢測濾紙干血片相關指標來實現的，血片質量直接影響檢測結果，且濾紙干血片同一血斑的不同打孔部位會對被檢項目濃度在切值附近檢測結果產生影響[3-4]。因此，血片打孔是實驗室檢測流程中的重要環節，規范操作對保證測定結果的準確至關重要[5]。既往濾紙干血片的質量評估及打孔取樣均為人工操作，耗時長、效率低，容易出錯。本研究旨在采用智能血卡分析系統、濾紙干血片自動打孔機、全自動熒光免疫分析儀和熒光定量法G6PD 測定試劑組成的新生兒濾紙干血片自動打孔檢測系統進行G6PD 檢測，并對其性能進行了評價，探討其在新生兒G6PD 缺乏癥篩查應用中的可行性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選 取2020 年12 月 至2021 年7 月 來 源 于 臨 床科研合作單位的104 份新生兒濾紙干血片剩余樣本，濾紙干血片G6PD 濃度值覆蓋濃度范圍在1.00～9.70 U/gHb。本研究所利用的剩余樣本均非本研究試驗目的專門采集，檢測結果僅用于方法學比對試驗，可視作對患者幾乎沒有任何風險，或受試者風險不大于最小風險，因此不再提交倫理委員會審評及受試者知情同意書[5-6]。

1.2 儀器與試劑

AutoTRFIA-4型全自動熒光免疫分析儀、KC2.0型智能血卡分析系統、Easy DBS 680型全自動打孔機、G6PD 測定試劑盒（熒光分析法）、濾紙干血片質控品和零濃度空白濾紙樣本均由廣州市豐華生物工程有限公司提供。新篩專用濾紙打孔鉗由北京協和洛克生物技術研究開發中心提供。G6PD 制劑由Worthington 公司提供。

1.3 方法

按照儀器及試劑盒說明書進行各項參數設置，用校準品校準后，測定質控品結果，結果在控時，分析測定G6PD 的檢測低限、線性、準確度、精密度和方法學比對試驗結果，并與可接受標準進行比較。

由KC2.0型智能血卡分析系統、Easy DBS 680型全自動打孔機、AutoTRFIA-4型全自動熒光免疫分析儀和熒光定量法G6PD 測定試劑盒組成新生兒濾紙干血片自動打孔檢測系統（簡稱自動打孔法），將新生兒血液采集卡放置于智能血卡分析系統中，采用數字圖像處理技術評估濾紙干血片的采集質量，合格的濾紙干血片遞送至全自動打孔機，通過圖像識別技術精確算出打孔位置，從濾紙干血片圓斑上打下直徑約為1/8 inch 的待測樣本，并依次自動固定在血片支架（塑料排釘）上；固定在血片支架上的待測樣本遞送至AutoTRFIA-4型全自動熒光免疫分析儀，執行G6PD 檢測程序；在白色板的微孔中每孔加入150 μl G6PD 底物試劑工作液，并依次將待測樣本放置于加有底物試劑的白色板微孔中，待測樣本與底物試劑在室溫下緩慢振蕩孵育30 min，移去扣有血片的支架，立即在白色板微孔中依次加入冷的銅試劑工作液（剛從冰箱取出，不復溫）150 μl/孔，混勻后，白色板傳送至判讀儀中進行檢測熒光計數值[單位：計數/秒（counts per second，CPs）]，并采用配套的軟件進行結果分析。以新生兒篩查專用濾紙打孔鉗手工打孔法檢測G6PD（簡稱直接打孔法）為參比方法，直接打孔法通過工作人員肉眼評估濾紙干血片質量，合格的濾紙干血片采用打孔鉗從濾紙干血片圓斑上手工打下直徑約為1/8 inch 的待測樣本，并將待測樣本依次直接放置于白色板的微孔中，向每孔中加入復溶好的G6PD 底物試劑150 μl，并加貼封片，在室溫下，緩慢振蕩30 min，立即加入冷的銅試劑工作液150 μl/孔，混勻，在判讀儀中檢測熒光計數值，并采用配套的軟件進行結果分析。

直接打孔法與自動打孔法平行檢測104份新生兒濾紙干血片剩余樣本。

1.4 評估指標

（1）檢測低限評價：檢測低限（lower limit of detection，LLD）定義為樣品單次檢測可以達到的檢測響應量對應的分析物量；在零濃度空白濾紙樣本的濾紙圓斑上打下10個血片檢測熒光計數值，計算出熒光計數值的均值（x-）和標準偏差（s），將（±s）的熒光計數值代入對應的劑量-反應曲線計算出相應濃度值，即為方法的LLD，應符合試劑盒的性能要求（LLD 不高于0.50 U/gHb）。（2）線性和準確度評價：采用已知活性的G6PD 制劑，制備覆蓋試劑盒線性范圍1.00～10.00 U/gHb 的5個系列梯度濃度的濾紙干血片樣本，在每個濃度的濾紙干血片圓斑上打下3個血片進行檢測，分別取各梯度的實測濃度平均值作為測量結果，再將測量結果與樣本理論濃度采用線性回歸分析，r應大于0.9900；計算每個樣本的測量結果與理論濃度的相對偏倚，應小于1/3總允許誤差，總允許誤差來源于國家衛生健康委臨床檢驗中心室間質量評價計劃的評價標準中G6PD 室間允許誤差（±30%）（簡稱G6PD 室間質評標準）。（3）精密度評價：使用同一批號的試劑盒和低水平（C1）、高水平（C2）2個濾紙干血片質控品，在每個水平的濾紙干血片圓斑上打下血片進行檢測，每天做2個批次的測試，每批測試時，對同一樣品作雙份測量，共做20 d；評價結束時共有40對，即80個測試結果，參考EP5-A2[7]的計算方法，從40批次測量中雙份結果的差值求出批內精密度；從所有80個數據計算出批間精密度；批內和批間變異系數（coefficient of variation，CV）應分別小于1/4允許總誤差和1/3允許總誤差，總允許誤差來源于G6PD 室間質評標準（30%）。（4）方法學比對試驗：直接打孔法與自動打孔法的檢測結果采用線性回歸分析，r應大于0.9900，截距a應與0的差異無統計學意義，采用線性回歸方程對試劑盒陽性判斷值2.5 U/gHb 進行預期偏倚估計，預期偏差的95%置信區間應在1/3總允許誤差（G6PD 室間質評標準）內，采用Bland-Altman分析法進行一致性評價時，兩種方法測定值差值中應不少于95%的樣本差值位于一致性界限（limit of agreement，LoA）范圍內[8]。

1.5 統計學處理

采用EXCEL 軟件和SPSS Statistics 20.0軟件進行數據統計分析，計量資料以±s 形式表述，方法學比對試驗定量結果間差異采用配對t檢驗，并進行線性回歸分析，r和截距a采用t檢驗分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 檢測低限

檢測G6PD 零濃度空白濾紙樣本熒光計數值為（384±10）CPs，95%的可信限為404 CPs，在劑量-反應曲線計算出LLD 為0.29 U/gHb，滿足試劑盒的LLD 性能要求。

2.2 線性和準確度評價

檢測理論濃度在0.96～10.20 U/gHb 范圍內的樣本，實測濃度與理論濃度的線性回歸方程為Y=1.0406X-0.0947，r=0.9996；實測濃度與理論濃度的相對偏倚均在可接受標準（±10%）內，見表1。

表1 線性和準確度評價結果

2.3 精密度

檢測質控品C1和C2的批內CV均在可接受標準（小于7.5%）內，批間CV均在可接受標準（小于10%）內，見表2。

表2 精密度評價結果

2.4 方法學比對

直接打孔法和自動打孔法平行檢測104例剩余樣本，兩種方法結果間差異無統計學意義（t=0.08，P>0.05），兩者檢測結果間的線性回歸方程為Y=0.9993X+0.0049，r=0.9991（tr=244.74，P＜0.05），截距a與0 的差異無統計學意義（t=0.20，P>0.05），見圖1。陽性判斷值2.50 U/gHb 的預期偏倚為0.0032 U/gHb，預期偏倚的95%置信區間為（-0.017，0.024）U/gHb，在陽性判斷值2.50 U/gHb的允許誤差范圍（-0.25，0.25）U/gHb 內，預期偏倚可以接受。Bland-Altman分析的LoA 為（-0.20，0.20）U/gHb，兩種方法檢測結果中有97.12%（101/104）的樣本差值在LoA 內，滿足可接受標準，見圖2。

圖1 兩種方法檢測樣本結果的線性回歸曲線

圖2 兩種方法檢測結果的一致性分析

3 討論

目前，新生兒濾紙干血片在檢測前多由人工驗收，驗收合格后的樣本多采用濾紙打孔鉗手工直接打孔法進行打取樣本，工作繁雜。新生兒濾紙干血片樣本的質量問題可導致假陰性引起篩查漏診，延誤患兒早診斷和早治療的最佳時機；假陽性過高也給新生兒及其監護人造成不必要復查和精神負擔[9]。因此，采用智能化的血卡分析系統和自動打孔系統進行新生兒濾紙干血片打孔檢測顯得非常必要。

本研究中的自動打孔法采用智能血卡分析和濾紙干血片自動打孔技術，采血卡采集血樣后，智能血卡分析系統通過工業級攝像頭完成對濾紙干血片血斑的取景成像，通過數字圖像處理技術，提取血斑閾值，識別血斑特征信息，可快速分析出采血卡采集的血斑是否有溶血、凝血、滲透不全和血液樣本量不足等異常特征，并將判斷結果通過網絡直接上傳至新篩中心服務器，且采血卡上會自動標識分析結果，方便工作人員對不合格樣本的新生兒及時召回并重新采集血樣；濾紙干血片自動打孔技術依靠精準的圖像識別技術，捕獲血斑成色并分層處理后，快速分析計算出合格的采血范圍及采血打孔位置，從而精準智能的進行血片血斑的打孔取樣；樣本依次固定在血片支架（塑料排釘）上，方便樣本一次性放入反應板孔內，自動打孔法不僅提高了篩查效率，節約實驗室人力資源，還可降低了因人工操作產生的誤差與風險，提高新生兒G6PD 缺乏癥篩查的質量[10]。近年有報道表明，應用Panthera-PuncherTM9型干血斑打孔儀進行新生兒杜氏肌營養不良癥篩查和G6PD 缺乏癥篩查，該打孔儀包含1個攝像頭可以實時提供打孔區域的清晰全彩視圖，以及自動調整的沖孔圖案來適應血斑的形狀和尺寸，可自動將干血斑樣本打沖至微孔板內，本研究的自動打孔原理與其相似[11-12]。

本研究中自動打孔法檢測G6PD 的LLD 滿足試劑盒的性能要求，線性范圍優于繆海霞等[13]研究結果；準確度與精密度均已達到要求；自動打孔法與直接打孔法檢測結果間無差異，且兩種方法的檢測結果具有高度相關性，陽性判斷值預期偏倚的95%置信區間在可以接受范圍內，采用Bland-Altman分析，自動打孔法與直接打孔法檢測結果一致性良好，兩者具有可互換性。

綜上所述，新生兒濾紙干血片自動打孔法可通過智能血卡分析技術快速分析出采血卡采集的血斑的異常特征，并可智能、精準、高效地進行濾紙干血片血斑的自動打孔取樣，LLD、線性、準確度和精密度等性能指標均符合可接受標準，且與直接打孔法檢測結果間的一致性良好，兩者具有可互換性。因此，自動打孔法應用于新生兒濾紙干血片樣本G6PD 檢測是可行的。