層次分析法結合響應面法優化黃芩湯的提取工藝*

陳振東，施洋，張曉霞，馬強，樊登峰，時歡歡

（克拉瑪依市中西醫結合醫院/克拉瑪依市人民醫院，新疆 克拉瑪依 834000）

黃芩湯出自張仲景的《傷寒論》，被譽為“萬世治痢之祖”，由黃芩、白芍、大棗、灸甘草四味藥材組成，具有清熱解毒、止痢、和中止痛的功效，臨床上常用于下利腹痛、身熱口苦、熱痢腹痛、舌紅、脈弦數等癥。方中君藥黃芩可解少陽之里熱，苦以堅之。臨床上常用于治療濕溫、瀉痢、血熱吐衄、癰腫瘡毒、胎動不安等[1-3]。研究中多將黃芩中的黃酮類化合物黃芩苷[4-7]作為質量控制的一個重要指標。臣藥白芍可解太陽之表熱而行營氣，酸以收之。現代藥理學表明，白芍中的苷類化合物芍藥苷[8-11]具有緩急止痛、解痙的功效。灸甘草、大棗為佐使藥，用以益氣和中，調和諸藥，配合君、臣以加強治療作用。研究中多將甘草中的黃酮類化合物甘草苷[12-14]作為質量控制的一個重要指標。因此，本研究將上述3種成分的含量作為檢測指標，采用層次分析法（AHP）構造成對比較的判斷優先矩陣，并獲得各項指標的相對評分，確定待測指標的權重系數。通過Box-Behnken響應面法結合層次分析法設計試驗，優選提取黃芩湯藥材的最佳工藝參數，為后續黃芩湯的研究開發提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UltiMate3000系列高效液相色譜（HPLC）儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Hypersil BDS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；UV-2501C紫外分光光度計（日本島津公司）；CPA-225D型電子天平（德國Sartorius）。

1.2 試藥 黃芩苷對照品（批號：110715-201619，含量：98.5%）、甘草苷對照品（批號：110916-201904，含量：97.5%）、芍藥苷對照品（批號：110617-201814，含量：98.5%）均購自中國食品藥品檢定研究院。黃芩、白芍、甘草均購于安徽省亳州市華云中藥飲片有限公司，經新疆藥物研究所何江副研究員鑒定為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根、毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根、豆科植物脹果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.的根莖，并均符合2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）有關規定。甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Hypersil BDS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B）-乙腈（C），梯度洗脫（0～8 min，15%A∶55%B∶30%C；8～12 min 30%A→35%A，45%B→50%B，25%C→15%C；12～28 min，20%A∶50%B∶30%C），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL，檢測波長為黃芩苷277 nm，芍藥苷230 nm，甘草苷254 nm。（見圖1）

圖1 HPLC 色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取黃芩苷、甘草苷、芍藥苷對照品適量，用甲醇分別配制成5.51、1.98、3.42 mg/mL的對照品儲備液。精密吸取黃芩苷對照品儲備液1.0 mL、甘草苷對照品儲備液2.5 mL、芍藥苷對照品儲備液1.2 mL，置于同一10 mL容量瓶中，混合搖勻，即得混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 稱取黃芩湯（黃芩15 g，白芍15 g，甘草10 g，大棗10 g）藥材50 g，10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并提取液，過濾，70%乙醇定容至250 mL，搖勻，濾過，即得。

2.2.3 陰性對照品溶液的制備 分別稱取缺黃芩、缺甘草、缺白芍的陰性對照藥材，分別加入10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并提取液，過濾，70%乙醇定容至250 mL，搖勻，濾過，即得。

2.2.4 空白對照溶液的制備 精密量取甲醇溶液5 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統適用性試驗 精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液及空白對照溶液各10 μL，按“2.1”項色譜條件進樣分析，結果見圖1。黃芩苷、芍藥苷、甘草苷與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數以各色譜峰計算均在8 220以上，說明在選定的色譜條件下，測定效果良好。

2.3.2 線性關系考察 分別精密吸取混合對照品溶液0.2、0.5、1.0、1.2、1.4 mL，分別置于10 mL容量瓶中，依次用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列混合對照品溶液。分別取各系列混合對照品溶液進樣分析，以峰面積（Y）為縱坐標，溶液的質量濃度（X，mg/mL）為橫坐標進行線性回歸，結果見表1。

表1 各成分線性關系

2.3.3 精密度試驗 取同一供試品溶液連續進樣6次，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，結果黃芩苷、芍藥苷、甘草苷的峰面積RSD分別為1.14%、1.19%和1.35%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、6、8、12、24 h進樣，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜峰面積并計算含量。結果黃芩苷、芍藥苷、甘草苷峰面積的RSD分別為1.20%、1.18%和1.37%，其峰形和含量變化不大，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.5 重復性試驗 取黃芩湯藥材6份，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜峰面積并計算含量，結果黃芩苷、芍藥苷、甘草苷含量的RSD分別為1.24%、1.15%和1.34%，表明該方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 稱取黃芩湯藥材約25 g，共6份，分別按處方藥材濃度的100%比例加入各對照品溶液，測得黃芩苷、芍藥苷、甘草苷的平均回收率分別為99.82%、98.80%、99.02%，RSD（n=6）分別為1.30%、1.20%、1.37%。加樣回收率試驗結果見表2。

表2 加樣回收率測定結果（n=6）

2.4 出膏率測定 精密吸取“2.2.2”項下供試品溶液50 mL，置于已恒重過的蒸發皿中（W1），水浴蒸干,105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速稱重（W），按下式計算浸膏得率。出膏率=[（W-W1）×V/（M×50）]×100%（W1為蒸發皿的質量，W為浸膏與蒸發皿總質量，V為溶液體積，M為藥材稱樣量）。

2.5 提取工藝綜合評分指標的確定 根據復方中藥味君、臣、佐、使配伍規律，采用層次分析法對出膏率和指標性成分含量作為權重指標予以量化。當一致性比例因子CR＜0.1時，判斷矩陣具有一致性[15-17]。

本研究根據黃芩湯藥材中活性成分黃芩苷、芍藥苷、甘草苷含量及出膏率4項指標為考查內容采用層次分析法構造成對比較的判斷優先矩陣，并獲得各項指標的相對評分（評分標準可參見文獻[15-17]的判斷矩陣1-9標度法）。（見表3）

表3 目標成對比較判斷優先矩陣

2.5.3 一致性檢驗 根據矩陣最大特征根公式（1）～（3）計算隨機一致性比率。

式中m為受檢驗層次的次目標數，CI為一致性檢驗因子，RI為平均隨機一致性指標，CR為矩陣最大特征根，表示一致性比例因子。

2.6 單因素試驗 本試驗以黃芩苷、芍藥苷、甘草苷的含量及出膏率的綜合評分進行評估，優選最佳因素。

2.6.1 乙醇濃度的考察 稱取黃芩湯藥材約50 g，粉碎過10目篩，加入10倍溶劑，提取2次，提取時間2 h，進行提取溶劑的考察。結果表明，以乙醇濃度為70%時各項含測指標的綜合評分最高，故選擇70%乙醇為提取溶劑。（見表4）

表4 單因素考察乙醇濃度結果

2.6.2 提取次數的考察 稱取黃芩湯藥材約50 g，粉碎過10目篩，加入10倍量70%乙醇，提取時間2 h，進行提取次數的考察。結果表明，提取次數為3時各項含測指標的綜合評分最高。（見表5）2.6.3 提取時間的考察 稱取黃芩湯藥材約50 g，粉碎過10目篩，加入10倍量70%乙醇，提取2次，進行提取時間的考察。結果表明，提取時間為1 h時，各項含測指標的綜合評分最高，故選擇提取時間1 h。（見表6）

表5 提取次數考察結果

表6 提取時間考察結果

2.7 響應面試驗

2.7.1 試驗結果 在單因素優選的基礎上結合響應面法對乙醇濃度（A）、提取次數（B）、提取時間（C）3個主要因素進行考察，以黃芩苷、甘草苷、芍藥苷的含量及出膏率為考察指標，各因素選取3個水平（-1、0、1），進行響應面設計，優選合理的條件組合，各因素水平見表7，試驗安排與試驗結果見表8，對試驗數據進行方差分析結果見表9。

表7 因素與水平表

表8 響應面試驗與結果

續表8：

采用Design Expert 12.0軟件進行響應面分析，以綜合評分為響應值，通過二階多項式進行回歸。得回歸方程Y=97.83-0.69A +2.71B +0.73C +0.47AB-0.22AC-1.18BC-14.07A2-1.43B2-3.98C2。由表9可知，建立的數學模型極顯著，差異有統計學意義（P＜0.05）。模型中的A、B、C、A2、B2、C2顯著，其他不明顯。結合模型（P＜0.000 1）及失擬項（P=0.228 1>0.05），說明試驗誤差較小。根據二次多項式模型，應用Design Expert 12.0軟件繪制三維響應曲面。由回歸模型進行預測分析，綜合評分的預測值98.83。最優提取條件為70%乙醇，回流提取2次，提取時間1 h。（見圖2）

表9 回歸模型的方差分析結果

圖2 綜合評分響應面圖

2.7.2 驗證試驗 根據響應面優化的最佳條件，平行稱取3份黃芩湯藥材約50 g，加入10倍量70%乙醇，回流提取2次，每次1.0 h。結果表明，黃芩苷、芍藥苷、甘草苷的含量及出膏率的綜合評分的相對誤差均小于5%，說明最佳提取工藝穩定，重現性好。（見表10）

表10 驗證試驗結果

3 討 論

采用HPLC法測定黃芩湯中黃芩苷、芍藥苷、甘草苷的含量過程中，嘗試了多種色譜系統，篩選流動相初期曾以甲醇-0.2%磷酸（40∶60）為流動相。色譜圖顯示僅黃芩苷、芍藥苷出峰，且峰形對稱性及分離度均較差，因此該洗脫系統不適用于本研究。考慮到甘草中的甘草苷未出峰，因此改換甲醇-0.2%磷酸溶液-乙腈為流動相進行梯度洗脫。色譜圖顯示黃芩苷、芍藥苷、甘草苷出峰時間較合適且峰形對稱、分離度佳。因此，選用甲醇-0.2%磷酸溶液-乙腈為流動相用于測定黃芩苷、芍藥苷、甘草苷的含量。該方法操作簡便、重現性好，一個色譜條件可同時測定黃芩苷、芍藥苷、甘草苷的含量，在保證樣品穩定性的前提下節省了大量時間。

3.1 含測指標加權系數的確定 由于黃芩湯藥材的成分復雜、指標成分較多，對于其提取工藝而言，選擇合適的指標成分尤為重要。本研究根據黃芩湯中藥材活性成分的重要程度，采用層次分析法對各成分進行系數加權，以加權后綜合評分為因變量，不僅能全面地反映各味藥材在黃芩湯中的作用，也能直觀地反映整體提取工藝。

3.2 Box-Behnken響應面法 通過多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系，能夠準確表示試驗設計與優化結果，準確度高、可預測性強。通過建立綜合評分與關鍵工藝參數的數學模型，并運用該模型預測最佳工藝為：70%乙醇，回流提取2次，每次1 h。驗證試驗結果與預測值相比，其誤差均小于5%，說明利用Box-Behnken響應面法設計提取工藝穩定、可靠，可為工業化生產提供一定的參考價值。

3.3 波長的選擇 由于黃芩苷、芍藥苷、甘草苷三者的最大吸收波長不同，為保證檢測的靈敏度和響應值最高，根據試驗篩選，發現黃芩苷277 nm、芍藥苷230 nm、甘草苷254 nm波長處均有較強吸收，為保證色譜峰峰度及分離度較佳，故選擇其作為檢測波長。