銀杏葉多糖提取工藝優化及其活性研究*

戴智強，高青青，賈麗娟，國大亮，商學良，劉玉璇

（1.天津中醫藥大學中醫學院，天津 301617；2.華北理工大學心理與精神衛生學院，河北 唐山 063210）

銀杏（Ginkgo biloba L.）為銀杏科、銀杏屬多年生落葉喬木，是植物界中名副其實的“活化石”，其葉、種子、花粉、樹根等都有不同藥用價值[1]。銀杏葉為銀杏樹的干燥葉片，主要含有黃酮類、萜內酯類、酚酸類、聚戊烯醇類、甾體類、多糖類等多種化學成分[2]。現代研究表明，銀杏葉多糖具有抗炎[3]、抗腫瘤[4]、抗肝纖維化[5]、增強免疫力[6]、降血糖[7]等藥理作用，并具有治療抑郁癥的潛在活性[8]，具有較高應用價值。目前，銀杏葉多糖的提取方法有熱水浸提法[9-10]和超聲輔助法[11-12]。熱水浸提法操作簡單，但需要高溫，提取時間較長；超聲輔助法要求復雜，不利于大規模生產。本研究使用纖維素酶輔助提取銀杏葉中多糖，與熱水浸提法和閃式提取法進行比較，并利用響應面法優化提取工藝條件，同時對銀杏葉多糖的抗氧化活性、清除亞硝酸鹽活性和免疫活性進行研究，旨在為銀杏葉多糖的綜合利用與開發提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 材料與試劑 銀杏葉由河北大中藥業有限公司提供，經天津中醫藥大學中醫學院劉玉璇教授鑒定為銀杏葉。纖維素酶（酶活力：315 000 U/g）購自天津市光復精細化工研究所；1,1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）（批號：C11482940）購自上海麥克林生科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸（批號：421L032）購自北京索萊寶科技有限公司；維生素C溶液購自天津市光復精細化工研究所；所有試劑為分析純；無水葡萄糖對照品（批號：1122A0220，含量：98%）、環磷酰胺（批號：6055-19-2）、免疫球蛋白G（IgG）試劑盒（批號：20220217）、免疫球蛋白A（IgA）試劑盒（批號：20220219）、免疫球蛋白M（IgM）試劑盒（批號：20220217）均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器 HH-4型數顯恒溫水浴鍋（常州朗越儀器制造有限公司）；800型電動離心機（金壇區西城新瑞儀器廠）；JHBE-50S型閃式提取器（北京金鼐科技發展有限公司）；TU-1810型紫外可見光分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.3 實驗動物 6～8周齡SPF級雄性ICR小鼠20只，體質量（30±3）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號：No.110322220100150962，動物生產許可證號：SCXK(京)2019-0008。小鼠于溫度為20～26℃、相對濕度為40%～60%、12 h/12 h晝夜光照循環、自由取食和飲水的條件下飼養，實驗結束時采用頸椎脫臼處死。本實驗遵循天津市醫學實驗動物保護中心的指導原則，方案經易生源基因科技(天津)有限公司的動物倫理委員會批準，嚴格按照動物倫理要求規范進行。

2 方 法

2.1 不同提取方法的考察

2.1.1 提取工藝路線 銀杏葉→洗凈→無水乙醇脫脂→烘干→粉碎過篩（80目）→稱量→提取方法考察→減壓過濾→濾液濃縮→4倍體積無水乙醇醇沉→4 ℃靜置12 h以上→離心（3500 r/min，10 min）→80%乙醇洗滌→干燥得銀杏葉多糖。

2.1.2 熱水浸提法單因素試驗 按照上述路線，進行水浴加熱提取，考察單個因素在提取過程中的影響，考察因素與區間有：液料比（10、20、30、40、50 mL/g）；水提溫度（50、60、70、80、90 ℃）；水提時間（1、2、3、4、5 h）。

2.1.3 酶解輔助法單因素試驗 按照“2.1.1”項下路線，在水浴加熱提取基礎上加入纖維素酶輔助提取，考察單個因素在提取過程中的影響，考察因素與區間有：液料比（10、20、30、40、50 mL/g）；酶解溫度（30、40、50、60、70 ℃）；酶解時間（30、60、90、120、150 min）；酶解pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）；酶用量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）。

2.1.4 閃式提取法單因素試驗 按照“2.1.1”項下路線，將銀杏葉片在一定溫度下浸泡一段時間后利用閃式提取器高速粉碎，考察單個因素在提取過程中的影響，考察因素與區間有：液料比（20、30、40、50、60 mL/g）、浸泡溫度（50、60、70、80、90 ℃）；閃式提取時間（40、60、80、100、120 s）。

2.1.5 多糖含量的測定 采用3,5-二硝基水楊酸法測定多糖含量[13]，使用紫外可見光分光光度計在540 nm處測定吸光度，以蒸餾水為空白對照，以葡萄糖質量濃度C（mg/mL）為橫坐標和吸光度A為縱坐標，得回歸方程A=1.674C-0.132 4，r=0.998 9，線性范圍為0.101 6～0.609 6 mg/mL。

稱取不同方法提取所得的多糖在蒸餾水中溶解，并按1∶1體積加入鹽酸（6 mol/mL），混勻后在沸水浴中加熱1 h，冷卻，用氫氧化鈉中和水解液至中性，過濾后定容，從中取1 mL測定吸光度值，計算多糖提取率，比較方法優劣。公式如下：

式中：C為測定樣品中多糖質量濃度（mg/mL）；V為定容體積（mL）；m2為試驗提取的總多糖質量（mg）；m1為稱取的多糖質量（mg）；M為銀杏葉粉末質量（g）。

2.2 響應面試驗設計 為進一步確認提取方法的最佳提取工藝條件，以單因素試驗為基礎，選取液料比（A）、酶用量（B）、酶解溫度（C）為自變量（其他條件固定為酶解時間90 min、酶解pH=5.0），以多糖提取率為響應值，運用軟件Design Expert 10.0.3設計響應面試驗進行優化，試驗設計因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平參數

2.3 多糖精制 最佳工藝下獲得的銀杏葉多糖，在使用木瓜蛋白酶脫蛋白和HPD100型大孔樹脂脫色處理后，灌裝至透析袋中，4 ℃透析72 h，冷凍干燥，得淡黃色粉末，即精制后銀杏葉多糖，純度為72.40%。

2.4 DPPH自由基清除率測定[14-15]取2.0mL DPPH（0.1mmol/mL），加入2.0 mL不同濃度的多糖溶液（0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL），混勻，避光靜置30 min后，在517 nm處測定吸光度，記為A1；用乙醇代替DPPH溶液測定吸光度值記為A2；用蒸餾水代替多糖溶液測定吸光度值記為A0。以VC溶液作對照，計算公式如下：

2.5 亞硝酸鹽清除率測定[16]取2.0 mL亞硝酸鈉標準溶液（5 μg/mL），加入1.0 mL不同濃度的多糖溶液（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL），混勻，40 ℃加熱10 min，加入2.0 mL 0.4%對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置5 min，再加入1.0 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺，混勻后靜置15 min，定容至50 mL，在538 nm處測定吸光度值，記為A1；用蒸餾水代替標準液測定吸光度值記為A2；用蒸餾水代替多糖溶液測定吸光度值記為A0，以VC溶液作對照，計算公式如下：

2.6 免疫活性研究 環磷酰胺是一種烷基化試劑，具有免疫抑制、減少白細胞等作用[17]，常用于建立免疫低下模型[18]。ICR小鼠在實驗環境中維持正常光照與喂食進行適應性喂養1周。采用隨機數字表法將20只小鼠分為正常組、模型組、銀杏葉多糖低劑量組、銀杏葉多糖中劑量組、銀杏葉多糖高劑量組，每組4只。除正常組外，其余各組小鼠腹腔注射環磷酰胺[40 mg/（kg·d）]；正常組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水，共5 d。若小鼠出現食欲不振、體質量下降，血清中免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA）水平明顯下降等情況則說明模型制備成功。銀杏葉多糖低、中、高劑量組小鼠分別灌胃給予銀杏葉多糖溶液（由生理鹽水配置），劑量分別為100、200、400 mg/（kg·d）；正常組和模型組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水，共14 d。末次給藥后12 h，取小鼠肝臟、脾臟、胸腺，計算器官指數；收集血清，測定免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA）含量。

2.7 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件對實驗數據進行分析，計量資料以“均數±標準差”（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 提取方法的選擇 各單因素試驗平行3次，比較提取率。酶解輔助法提取銀杏葉多糖效果明顯優于其余兩種方法（P＜0.05或P＜0.01），故選擇酶解輔助法進行后續響應面優化試驗。（見表2）

表2 不同方法提取銀杏葉多糖的提取率（mg/g）

3.2 響應面法優化銀杏葉多糖提取工藝條件

3.2.1 響應面試驗設計及結果 使用軟件Design-Expert 10.0.3中Response Surface的中心復合設計模塊設計響應面試驗，以獲得酶解輔助法提取銀杏葉多糖最佳提取工藝條件，試驗參數與結果見表3。

3.2.2 方差分析與回歸模型顯著性檢驗 通過軟件Design-Expert 10.0.3對表3中結果進行方差分析，以多糖提取率為響應值Y得到回歸方程：Y=25.11+1.02A-0.64B+0.40C+0.11AB-0.24AC-0.25BC-2.01A2-2.27B2-1.89C2。3個因素與響應值之間存在非線性關系。回歸方程顯著性檢驗與方差分析結果見表4，可知該模型回歸顯著（P＜0.000 1），且模型失擬項不顯著（P=0.095 4＞0.05），其中R2=0.974 7，校正R2=0.951 9，說明模型擬合較好，具有較高可信度，可以解釋95.19%響應值的變化；結合方差分析結果可以看出FA（31.06）＞FB（12.30）＞FC（4.85），即對銀杏葉多糖提取率的影響大小依次為A、B、C。

表3 中心復合設計試驗參數及結果

表4 方差分析與顯著性檢驗

3.2.3 響應面分析 根據模型的回歸方程，對兩兩因素間交互作用進行分析，制作液料比（A）、酶用量（B）、酶解溫度（C）響應曲面分析圖，見圖1～3。因素間交互作用越顯著，曲面坡度越陡峭，等高線越密集越偏橢圓形。結合各圖中3D響應曲面平滑程度與等高線輪廓情況可知，液料比（A）與酶用量（B）、料液比（A）與酶解溫度（C）、酶用量（B）與酶解溫度（C）之間因素交互作用不明顯，與方差分析結果相同。

圖1 液料比與酶用量的交互作用響應面圖

圖2 料液比與酶解溫度的交互作用響應面圖

圖3 酶用量與酶解溫度的交互作用響應面圖

3.2.4 最佳提取工藝驗證 通過軟件Design Expert 10.0.3對回歸模型進行二次回歸，預測液料比32.44 mL/g、酶用量1.93%、酶解溫度51.03 ℃為酶解輔助法提取銀杏葉多糖最佳工藝條件，預測提取率為25.30 mg/g。根據實際試驗條件與操作進行修正為液料比32 mL/g、酶用量1.9%、酶解溫度51 ℃，并進行3次試驗驗證，提取率結果為（25.08±0.33）mg/g。實際值與理論值相近，表明優化過程所獲得工藝條件參數良好、可靠，該提取工藝模型能夠較好預測銀杏葉多糖提取工藝。

3.3 DPPH自由基清除率測定結果 隨銀杏葉多糖溶液濃度增加，其清除DPPH自由基的能力迅速上升；當銀杏葉多糖溶液濃度為1.0 mg/mL時，DPPH自由基清除率為92.76%，說明銀杏葉多糖有較強的DPPH自由基清除效果。（見圖4）

圖4 DPPH 自由基清除率

3.4 亞硝酸鹽清除率測定結果 銀杏葉多糖的清除亞硝酸鹽能力隨濃度增加而逐漸增強，均優于同濃度下的VC溶液；當銀杏葉多糖溶液濃度為1.0 mg/mL時，亞硝酸鹽清除率達90.03%，說明銀杏葉多糖具有較強的亞硝酸鹽清除能力。（見圖5）

圖5 亞硝酸鹽清除率

3.5 免疫活性實驗結果 與正常組比較，模型組小鼠肝臟指數、脾臟指數、胸腺指數及血清中IgG、IgM、IgM含量均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。銀杏葉多糖中劑量組小鼠脾臟指數明顯高于模型組（P＜0.05）；銀杏葉多糖高劑量組小鼠肝臟指數、脾臟指數、胸腺指數均明顯高于模型組（P＜0.05或P＜0.01），說明高濃度銀杏葉多糖溶液能夠有效修復環磷酰胺對免疫器官的損傷。銀杏葉多糖中劑量組小鼠血清中IgG含量明顯高于模型組（P＜0.05）；銀杏葉多糖高劑量組小鼠血清中IgG、IgM、IgM含量均明顯高于模型組（P＜0.01），說明高濃度銀杏葉多糖對免疫球蛋白的分泌抑制具有良好恢復效果。（見表5）

表5 各組小鼠器官指數及血清免疫球蛋白含量比較（±s）

表5 各組小鼠器官指數及血清免疫球蛋白含量比較（±s）

注：與模型組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

4 討 論

銀杏葉多糖提取率除受方法和工藝的影響外[19]，同時受產地、采摘季節的客觀因素影響[20]。本試驗中銀杏葉提取率最高可達2.6%。酶解輔助法利用酶破壞植物細胞壁，使有效成分溶出，操作簡單而高效[21]。本研究比較了3種不同提取方法單因素試驗的提取率，結果顯示纖維素酶解輔助法能夠有效提高銀杏葉多糖的提取率，相比于其他提取方法存在一定優勢。響應面優化試驗方差分析結果顯示，影響提取率因素大小關系與單因素試驗中的因素影響程度相符，且響應面試驗預測工藝下的預測結果與實際驗證試驗結果接近，進一步說明該優化工藝參數良好、可靠。

銀杏葉多糖的抗氧化和清除亞硝酸鹽活性與銀杏葉多糖溶液濃度之間均呈現出良好的量效關系，且銀杏葉多糖清除亞硝酸鹽的效果優于VC溶液。脾臟、胸腺、肝臟是體內的免疫器官，均參與機體免疫應答環節中[22]。本研究中3個濃度銀杏葉多糖溶液均能增加免疫低下小鼠的免疫器官指數，呈現濃度依賴性，其中銀杏葉多糖高劑量組效果明顯優于其余兩組，說明銀杏葉多糖能夠對環磷酰胺所致免疫器官的萎縮產生逆轉功效，有提升機體免疫的作用。當機體受抗原刺激時，免疫應答可由淋巴B細胞轉化的漿細胞分泌免疫球蛋白的方式進行，阻斷其對機體危害的同時，也使抗原失去作用[23]。銀杏葉多糖低、中、高劑量組小鼠血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA含量均高于模型組，且銀杏葉多糖高劑量組效果顯著，呈濃度依賴性，說明銀杏葉多糖能夠增強免疫細胞分泌免疫球蛋白，進而增強機體免疫。銀杏葉多糖能夠通過以上方式增強免疫系統的調節能力。

綜上所述，本研究采用的纖維素酶解輔助法提取銀杏葉多糖的方法具有操作簡易、條件溫和、能耗低等特點，對于實際生產具有借鑒意義。銀杏葉多糖可作為一種天然植物來源成分，用做抗氧化劑、亞硝酸鹽清除劑或免疫增強劑。