N乙酰L纈氨酸的合成與分析

摘要：建立高效液相色譜紫外檢測分離測定L纈氨酸和N乙酰L纈氨酸的方法，以此為手段對N乙酰L纈氨酸的制備過程進(jìn)行監(jiān)控。研究了以L纈氨酸為原料，乙酸酐為乙酰化試劑制備N乙酰L纈氨酸的工藝。確定了乙酰化反應(yīng)條件、中和結(jié)晶條件等，獲得的優(yōu)化工藝條件為：100 gL纈氨酸，500 mL水，90 mL乙酸酐，溫度35 ℃，pH 8.0，反應(yīng)時間2 h。隨后用37%濃鹽酸中和至pH 1.5，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷卻結(jié)晶12 h，得N乙酰L纈氨酸產(chǎn)品。母液濃縮回收利用。產(chǎn)品總收率為122%，通過FTIR，HNMR和HPLC對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證，質(zhì)量達(dá)到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞：N乙酰L纈氨酸；乙酰化；L纈氨酸L纈氨酸是組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸之一，屬于支鏈氨基酸，也是人體必需的8種氨基酸和生糖氨基酸，與異亮氨酸和亮氨酸一起作用可以促進(jìn)身體正常生長，修復(fù)組織，調(diào)節(jié)血糖，并提供機(jī)體所需要的能量［1］。N乙酰L纈氨酸為重要的精細(xì)有機(jī)化工中間體，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、化學(xué)工業(yè)等領(lǐng)域［2］。氨基酸均有一個aNH2，可以與適當(dāng)?shù)囊阴；噭┓磻?yīng)，常用的乙酰化試劑有乙酸、乙酰氯和乙酸酐。使用乙酸進(jìn)行乙酰化需在高溫下反應(yīng)，易導(dǎo)致氨基酸消旋；乙酰氯的反應(yīng)活性過強(qiáng)，容易水解，不宜在水溶液中進(jìn)行反應(yīng)。因此最常用的乙酰化試劑是乙酸酐，在微堿性的水溶液中與氨基酸反應(yīng)生成乙酰氨基酸［35］。

已有N乙酰L酪氨酸、N乙酰L半胱氨酸、N乙酰L亮氨酸、N乙酰L谷氨酸、N乙酰L蘇氨酸等乙酰氨基酸制備的報道［611］。基本工藝是：將氨基酸溶解在弱堿性水溶液中，加入乙酸酐進(jìn)行乙酰化反應(yīng)，再從反應(yīng)液中分離提取目標(biāo)產(chǎn)物。由于各種氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)不同，物理、化學(xué)性質(zhì)有很大差異，因此制備各種乙酰氨基酸的工藝方法和工藝參數(shù)都有所不同。尚未報道N乙酰L纈氨酸的制備。

高效液相色譜結(jié)合紫外檢測已被用于酪氨酸等氨基酸的分離測定［1214］，也被用于某些乙酰氨基酸的分離測定，如乙酰半胱氨酸，乙酰酪氨酸等［1520］。但未見分離測定L纈氨酸和N乙酰L纈氨酸的報道。

本文首先建立了一種高效液相色譜紫外檢測分離測定L纈氨酸和N乙酰L纈氨酸的方法。以此為手段對制備N乙酰L纈氨酸的工藝過程進(jìn)行監(jiān)控，研究了乙酸酐用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等對乙酰化反應(yīng)的影響，研究了產(chǎn)品的優(yōu)化結(jié)晶條件，由此確定優(yōu)化的制備工藝參數(shù)。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

LabTECH高效液相色譜儀：北京萊伯泰科儀器有限公司，配備紫外檢測器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-301E）：上海互佳儀器設(shè)備有限公司）；酸度計（PHS-25）：杭州雷磁分析儀器廠；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-10S）：天津華鑫儀器有限公司；蠕動泵（BT-100）：重慶杰恒蠕動泵有限公司；循環(huán)水式多用真空泵（SHZ-D140）、傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet iS50）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；500 MHz核磁共振譜儀：AVANCE，美國布魯克科技有限公司。

L纈氨酸：工業(yè)級，江蘇漢菱生物工程有限公司提供；L纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：采用工業(yè)級L纈氨酸精制；N乙酰L纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：自制N乙酰L纈氨酸再精制；乙酸酐： 分析純；氫氧化鈉：工業(yè)級片堿，重慶天原化工公司；濃鹽酸：37%，分析純；甲醇為色譜純試劑。其他試劑為分析純以上。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1高效液相色譜分離測定L纈氨酸和N乙酰L纈氨酸1.2.1.1標(biāo)準(zhǔn)對照液的制備

分別稱取0.250 g L纈氨酸、N乙酰L纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，混合后加水溶解，轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中以水定容，得質(zhì)量濃度為1.00 g/L的L纈氨酸、N乙酰L纈氨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。試驗(yàn)時根據(jù)需要，準(zhǔn)確移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋至一定體積，制備一定質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)對照液。

1.2.1.2供試液的制備方法

準(zhǔn)確移取或稱取適量的樣品，用水溶解后轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中定容。

1.2.1.3色譜條件

色譜柱（C18，5 μm，250×4.6 mm id），流速0.8 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣體積20 μL，檢測波長210 nm。

流動相：40/60甲醇/10 mmol/L磷酸鹽，pH 3.0。其中10 mmol/L磷酸鹽溶液：稱取1.36 g磷酸二氫鉀，加水約900 mL溶解，用10%稀磷酸調(diào)pH至3.0，再加水至1 000 mL。

1.2.2N乙酰L纈氨酸的制備方法

1.2.2.1L纈氨酸的乙酰化

將250 mL三口瓶置于磁力攪拌恒溫水浴鍋中，加入10 g L纈氨酸、100 mL水，將酸度計的pH電極插入瓶中監(jiān)控物料pH。調(diào)節(jié)水浴鍋溫度至規(guī)定值，滴加30%NaOH至規(guī)定的pH。此時為乙酸酐加入零點(diǎn)，開始滴加規(guī)定量乙酸酐，同時滴加30%NaOH維持在規(guī)定的pH，滴加乙酸酐總耗時2 h，滴加完乙酸酐后再反應(yīng)0.5 h。

1.2.2.2中和結(jié)晶

加37%濃鹽酸中和至pH 1.5。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至70 mL，降溫，攪拌結(jié)晶，12 h后抽濾，用水洗3次，80 ℃烘干得N乙酰L纈氨酸精品。母液另行處理。

1.2.2.3回收母液中N乙酰L纈氨酸

母液與洗水合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至出現(xiàn)結(jié)晶，緩緩降溫，攪拌結(jié)晶，12 h后抽濾，得N乙酰L纈氨酸粗品，可用于下一批乙酰化時配料。

2結(jié)果與討論

2.1分析方法的建立

通過實(shí)驗(yàn)研究，建立了高效液相色譜分離測定L纈氨酸和N乙酰L纈氨酸的方法。典型色譜圖見圖1。

2.2乙酰化反應(yīng)的影響因素

乙酸酐是氨基進(jìn)行乙酰化的常用試劑，其反應(yīng)活性適中，反應(yīng)條件易控制。可在水溶液中與氨基酸的氨基反應(yīng)生成N乙酰氨基酸。本研究選擇乙酸酐對L纈氨酸進(jìn)行乙酰化，反應(yīng)式見圖2。

在水溶液中，乙酸酐還會發(fā)生水解副反應(yīng)，導(dǎo)致參與主反應(yīng)的乙酸酐減少，需要增加乙酸酐用量。在乙酰化反應(yīng)和乙酸酐水解過程中都會生成大量乙酸，為維持反應(yīng)體系的pH，需加堿中和反應(yīng)中產(chǎn)生的乙酸。

2.2.1乙酸酐用量對乙酰化反應(yīng)的影響

采用1.2.2.1的方法，控制乙酰化反應(yīng)pH在8.0左右，水浴溫度為35 ℃，在滴加乙酸酐反應(yīng)階段，每滴加一定量乙酸酐，暫停滴加乙酸酐，但繼續(xù)滴加30%NaOH維持pH，至pH不再降低為止。按1.2.1的方法對反應(yīng)液取樣，進(jìn)行液相色譜分析，測定其中L纈氨酸和N乙酰L纈氨酸的含量，根據(jù)測定結(jié)果及取樣時物料總質(zhì)量，計算L纈氨酸和N乙酰L纈氨酸在反應(yīng)液中的質(zhì)量。結(jié)果見圖3。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)初期，溶液中的L纈氨酸與滴入的乙酸酐反應(yīng)，導(dǎo)致其質(zhì)量逐漸降低；生成N乙酰L纈氨酸的質(zhì)量逐漸升高。直至乙酸酐用量達(dá)到9 mL以后N乙酰L纈氨酸曲線逐漸走平，殘留在反應(yīng)液中的L纈氨酸趨近于0 g。

表明L纈氨酸已被全部乙酰化，不再有新的N乙酰L纈氨酸生成。

理論上10 g L纈氨酸（0.085 4 mol）乙酰化需消耗乙酸酐8.1 mL。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)乙酸酐加入量為9 mL，即理論加入量的111%時， 溶液中已無L纈氨酸存在。為保證L纈氨酸反應(yīng)完全，本研究選擇乙酸酐加入量為9 mL。

2.2.2反應(yīng)pH對乙酰化反應(yīng)的影響

乙酸酐對氨基酸乙酰化一般宜在微堿性水溶液中進(jìn)行，為考察反應(yīng)pH對乙酰化反應(yīng)的影響，按1.2.2.1的方法，控制乙酰化反應(yīng)pH為不同值，水浴溫度為35 ℃，均滴加9 mL乙酸酐，反應(yīng)終止后取樣分析，計算反應(yīng)液中L纈氨酸和N乙酰L纈氨酸的質(zhì)量，結(jié)果見圖4。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在pH 8～9的條件下乙酰化，都可以將L纈氨酸全部轉(zhuǎn)化為N乙酰L纈氨酸；在pH 7的條件下乙酰化，會有少量L纈氨酸殘留；在pH 10的條件下乙酰化，也有少量L纈氨酸殘留。后面兩種情況下如果繼續(xù)滴加乙酸酐，仍然可以將所有L纈氨酸全部乙酰化，總的效果就是增大了乙酸酐的消耗量。本研究選擇在pH 8.0的條件下進(jìn)行乙酰化反應(yīng)。

2.2.3反應(yīng)溫度對乙酰化反應(yīng)的影響

為考察反應(yīng)溫度對乙酰化反應(yīng)的影響，按1.2.2.1的方法，控制乙酰化反應(yīng)pH為8.0，控制水浴溫度為規(guī)定值，均滴加9 mL乙酸酐，反應(yīng)終止后取樣分析，計算反應(yīng)液中L纈氨酸和N乙酰L纈氨酸的質(zhì)量。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 在25～55 ℃范圍內(nèi)，反應(yīng)溫度對乙酰化反應(yīng)沒有明顯的影響，在55 ℃下乙酰化，反應(yīng)液中殘留少量L纈氨酸，僅占總量的1%左右。25～45 ℃條件下乙酰化，所有L纈氨酸全部乙酰化。本研究選擇在35 ℃下進(jìn)行乙酰化反應(yīng)。

2.2.4反應(yīng)時間對乙酰化反應(yīng)的影響

由于可能存在乙酸酐水解的副反應(yīng)，因此在乙酰化反應(yīng)過程中，采用滴加乙酸酐的方式，而不是一次性加入全部乙酸酐。滴加乙酸酐的速度可能影響乙酰化反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙酰化反應(yīng)速度較快，滴加速度對乙酰化反應(yīng)沒有太大的影響，1 h滴完與3 h滴完乙酸酐，測定反應(yīng)液中各組分質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)乙酰化反映的情況沒有明顯區(qū)別。考慮到滴入的乙酸酐在溶液中的攪拌分散情況，以及乙酸酐水解影響，滴入乙酸酐不應(yīng)太快。本研究選擇在2 h內(nèi)滴完乙酸酐。

2.3N乙酰L纈氨酸的中和結(jié)晶

水解后的反應(yīng)液中含有目標(biāo)產(chǎn)物N乙酰L纈氨酸，還含有高質(zhì)量濃度的乙酸鈉及少量其他副產(chǎn)物。需將目標(biāo)產(chǎn)物從反應(yīng)液中結(jié)晶分離出來。

N乙酰L纈氨酸有一個游離羧基，其酸堿性質(zhì)類似于乙酸，在較高pH下部分離解生成帶負(fù)電荷的離子。只有在較低的pH條件下才會以不帶凈電荷的中性分子形式存在，此時其溶解度最低。因此實(shí)驗(yàn)中加入鹽酸中和至pH 1.5。

由于N乙酰L纈氨酸在溶液中的溶解度較大，需將中和液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至70 mL，取下冷卻結(jié)晶，20 ℃條件下過濾分離，洗滌，干燥得到N乙酰L纈氨酸精品10.6 g。得母液52 mL， 其中N乙酰L纈氨酸質(zhì)量濃度為19 g/L，質(zhì)量為0.98 g。洗水30 mL，其中N乙酰L纈氨酸質(zhì)量濃度為50.5 g/L，質(zhì)量為1.52 g。

經(jīng)檢測，N乙酰L纈氨酸產(chǎn)品質(zhì)量符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（見表1）。

2.4母液處理

產(chǎn)品結(jié)晶母液及洗水中還含有一定量的N乙酰L纈氨酸，如果能部分回收，則產(chǎn)品收率可進(jìn)一步提高。此母液中還含有高濃度的乙酸鈉和氯化鈉。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，N乙酰L纈氨酸在純水中的溶解度較大，在含有乙酸鈉和氯化鈉的溶液中溶解度較小。在飽和鹽溶液中溶解度最小。因此，將結(jié)晶母液及洗水合并，再旋蒸至鹽結(jié)晶剛剛出現(xiàn)，冷卻，使N乙酰L纈氨酸結(jié)晶析出，過濾，不洗，可得N乙酰L纈氨酸粗品2.3 g（干重），經(jīng)HPLC測定其中含N乙酰L纈氨酸70%，總量為1.6 g。此粗品在下一批次乙酰化時加入反應(yīng)液中。

2.5原料消耗定額及產(chǎn)品收率

按照本研究選定的工藝條件進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)，每次固定投料量為100 g L纈氨酸，并投入上一批次母液中回收的N乙酰L纈氨酸粗品，連續(xù)運(yùn)行4批。得到制備N乙酰L纈氨酸工藝的原料消耗定額和產(chǎn)品收率，結(jié)果見表2。

3產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征

3.1FTIR

主要官能團(tuán)的吸收頻率為：υ（O—H），3 303 cm-1，υ（N—H），3 101 cm-1，2 968 cm-1，υas（COO），1 604 cm-1，υs（COO），1 396 cm-1，υ（C—O），1 205 cm-1，由此可以確定該譜圖為N乙酰L纈氨酸的紅外吸收光譜圖（見圖5）。

3.2HNMR

圖6為產(chǎn)物HNMR。由圖6可見：d=12.50處為—COOH中氫原子的共振峰，是受氨基吸電子效應(yīng)影響的氫。d=8.00處為QSChNa中氫原子的共振峰；d=4.13處為—NH中氫原子的共振峰；d=1.87～2.06處為—CH2中氫原子的共振峰；d=0.87處為產(chǎn)物以甲基封端的—CH3的氫原子共振峰。

綜合FT-IR和HNMR表征結(jié)果，證明產(chǎn)品為N乙酰L纈氨酸。

4結(jié)論

在微堿性水溶液中，用乙酸酐乙酰化L纈氨酸可制備N乙酰L纈氨酸。工藝條件溫和，操作簡便。優(yōu)化工藝條件為：

（1） 乙酰化：100 g L纈氨酸，1 000 mL水，35 ℃，滴加90 mL乙酸酐，滴加30%NaOH保持pH 8.0。滴加乙酸酐時間2 h。

（2） 中和結(jié)晶：加37%濃鹽酸中和至pH 1.5。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至溶液體積700 mL，冷卻結(jié)晶12 h，抽濾，洗滌，80 ℃烘干得N乙酰L纈氨酸精品。

（3） 母液處理：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至出現(xiàn)結(jié)晶，冷卻結(jié)晶12 h，抽濾，得N乙酰L纈氨酸粗品，可用于下一批乙酰化時配料。產(chǎn)品總收率為122%，產(chǎn)品質(zhì)量符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

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