六味地黃丸含藥血清通過誘導自噬對氧化應激狀態下成骨細胞增殖的影響

郭瀾 李莉 葛繼榮* 黃景文 柴昊 謝麗華 陳娟 許鵬超

1.福建省中醫藥科學院，福建 福州 350003

2.福建省中西醫結合防治骨質疏松重點實驗室，福建 福州 350003

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種全身性骨代謝疾病，以單位體積骨量減少，骨組織微結構破壞為特征，表現為骨脆性增加，骨折風險增高[1]。目前的調查顯示，在我國50歲以上人群中，女性OP發病率達20.7%，男性達14.4%[2]，并且預計到2050年，中老年女性的發病率將高達50%～70%[3]。研究證明，絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)的發病機制與雌激素調控、氧化應激和炎癥反應、腸道菌群及鐵過載等相關[4]。當機體受到有害刺激時會生成大量的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，若不能被機體及時清除，便會打破氧化/抗氧化平衡，對組織或細胞造成損傷，這種病理反應稱之為氧化應激[5-6]，是PMOP的重要發病機制之一[7]。自噬是細胞在饑餓、毒性物質刺激等狀態下，自噬小體與溶酶體結合以降解受損的細胞器或功能喪失的大分子蛋白等物質，再供給細胞以維持正常生理功能的過程，對機體的物質循環再利用、維護細胞內環境穩定等起到重要作用[8-9]。研究表明，自噬和氧化應激與骨穩態的維持及OP的發生發展有著必然的聯系，靶向調節骨組織細胞自噬水平可以作為一種前瞻性治療OP的新方法[10]。中醫的“骨痿”“骨枯”等范疇，其中肝腎陰虛型OP的推薦用藥之一為六味地黃丸[11]。本研究通過H2O2誘導成骨細胞模擬細胞氧化應激狀態，之后采用六味地黃丸含藥血清共培養，探討六味地黃丸含藥血清對成骨細胞增殖、ROS及自噬水平的影響，為六味地黃丸臨床治療OP提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

MC3T3-E1細胞于中國科學院細胞庫購買；SD大鼠購于上海斯萊克；α-MEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco，美國)，青鏈霉素雙抗混合液、磷酸緩沖鹽溶液(上海源培公司，中國)，自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)、H2DCFDA、CCK-8試劑盒(MedChemExpress，美國)；六味地黃丸濃縮丸(同仁堂，中國)。RIPA裂解緩沖液(碧云天，中國)；Product Information(APExBIO，美國)；BCA蛋白分析試劑盒(雅酶，中國)；Rabbit Anti-β-actin(bioss，bs-0061R)，Anti-Beclin 1 antibody(Abcam，ab207612)，Anti-LC3B(abcam，ab192890)；特超敏ECL化學發光試劑盒(碧云天，中國)。

1.2 實驗方法

1.2.1制備六味地黃丸含藥血清：將40只SD大鼠隨機分為空白組和六味地黃丸組，先于動物房適應性喂養一周。根據六味地黃丸說明書，成人一天總用藥量相當于中藥飲片9 g，參照徐叔云等[12]的方法，制備生藥質量濃度為0.8 kg/L的六味地黃丸水溶液，按每天1.0 mL/100 g對六味地黃丸組大鼠進行灌胃，空白組用等量蒸餾水灌胃。在第7天首次灌藥2 h后，麻醉大鼠進行腹主動脈取血以制備六味地黃丸(LWDH)含藥血清及空白血清。

1.2.2細胞培養：細胞培養基選用α-MEM培養基，其中含有10%體積分數的胎牛血清，1%體積分數的青鏈霉素。培養環境為37 ℃，5%體積分數CO2的培養箱中。細胞復蘇后2 d換液一次，當細胞鋪滿培養皿80%～90%時傳代，當細胞處于對數生長期時進行實驗。

1.2.3CCK-8檢測：將MC3T3-E1細胞接種于96孔板，每組設置3～4個副孔，于培養箱中靜置24 h以待細胞貼壁，后吸走原有培養基，用H2O2(0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mmol/L)干預24 h；另外一板細胞用體積分數5%、10%、20%、30%的空白血清、LWDH含藥血清干預24 h，后用0.10 mmol/L H2O2繼續干預至48 h。干預結束后，按照10 μL/孔加入CCK-8試劑，繼續于培養箱中孵育1 h，用酶標儀測定波長450 nm處吸光值，記錄并根據公式計算細胞增殖率。

1.2.4分組及干預：正常對照組(Control)：不做干預；模型組(Model)：0.10 mmol/L H2O2干預24 h；空白對照組(H+Blank)：20%空白血清干預24 h，0.10 mmol/L H2O2干預24 h；六味地黃丸組(H+LWDH)：20%六味地黃丸含藥血清干預24 h，0.10 mmol/L H2O2干預24 h；自噬抑制劑組(3-MA+LWDH)：3-MA提前干預1 h，再用20%六味地黃丸含藥血清共同干預24 h。

1.2.5細胞活性氧水平檢測：將MC3T3-E1細胞接種于6孔板，根據實驗分組干預后，采用熒光探針DCFH-DA檢測每組細胞的ROS的含量。根據DCFH-DA試劑盒說明書，用PBS配制熒光探針(DCFH-DA)稀釋液(探針濃度為10 μmol/L)，每孔加入適量的含有探針的PBS溶液，于培養箱中靜置1 h，棄去PBS，用新的PBS輕柔清洗2遍。閉光置于倒置熒光顯微鏡下觀察，并拍照保存。

1.2.6qRT-PCR檢測目的mRNA表達：將MC3T3-E1細胞接種于6孔板，于培養箱中培養24 h細胞貼壁后根據分組進行干預。干預結束后，根據分組收集細胞，提取RNA，逆轉錄成cDNA后，采用qRT-PCR檢測成骨細胞Beclin 1、LC3B mRNA表達水平。由上海生工公司完成引物設計，具體引物信息見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences of PCR

1.2.7蛋白印跡法：根據分組收集細胞，使用RIPA裂解緩沖液、Product Information提取細胞中的總蛋白，并通過BCA蛋白分析試劑盒進行蛋白定量。SDS-PAGE凝膠上進行電泳分離，然后將蛋白轉移至PVDF膜上，轉膜時間根據蛋白分子量確定。用脫脂奶粉4 ℃封閉4 h后，加入相對應的一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后，加入二抗Goat Anti-Rabbit IgG H&L antibody (bs-0295 G)，室溫孵育1.5 h，TBST洗滌4次，每次15 min。使用特超敏ECL化學發光試劑盒曝光，用多色熒光/化學發光成像儀(protein simple，美國)拍照保存。

1.3 統計學分析

所有實驗均獨立重復3次。數據先進性正態檢驗，符合正態分布采用均數±標準差進行描述，使用SPSS 22.0進行統計學分析。若數據符合正態分布，則進行單因素方差分析；若數據不符合正態分布，則進行非參數檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 過氧化氫對成骨細胞增殖的影響

H2O2的濃度為0.10 mmol/L時，相比于對照組，成骨細胞的平均增值率為70.65%，此濃度對成骨細胞增殖的抑制作用較為顯著(P<0.05)；H2O2的濃度為0.20 mmol/L時，成骨細胞平均增殖率不足20%。可見，H2O2對成骨細胞的增殖具有抑制作用，且濃度為0.10 mmol/L時具有相對較小程度的抑制增殖效果，因此選取此濃度進行后續實驗研究。見圖1。

圖1 H2O2濃度對成骨細胞增殖的影響Fig.1 Effect of H2O2 concentration on osteoblast proliferation

2.2 六味地黃丸含藥血清對氧化應激狀態下成骨細胞增殖的影響

CCK-8結果顯示，空白血清對成骨細胞增殖的作用不明顯(P>0.05)；而LWDH含藥血清對成骨細胞增殖的促進作用呈現一定的劑量依賴性，且體積濃度為20%時，對成骨細胞的增殖促進效果最佳，與空白組對比差異最顯著(P<0.05)。LWDH含藥血清濃度大于20%后，開始對成骨細胞增殖出現抑制作用。因此，選取LWDH含藥血清體積濃度為20%進行后續實驗研究。見圖2。

圖2 血清濃度對成骨細胞增殖的影響Fig.2 Effect of serum concentration on osteoblast proliferation

2.3 六味地黃丸含藥血清對H2O2所致成骨細胞氧化損傷的影響

熒光定量分析結果顯示，與Control組相比，Model組的熒光強度顯著增強(#P<0.05)，說明在H2O2的干預下，成骨細胞處于氧化應激狀態。與Model組相比，H+Blank組熒光輕度有所減弱，但差異無統計學意義(P>0.05)；H+LWDH組熒光強度顯著減弱(*P<0.05)。說明LWDH含藥血清可以降低細胞的ROS水平，減輕H2O2對成骨細胞造成的氧化損傷。見圖3。

2.4 六味地黃丸含藥血清對自噬相關基因mRNA表達的影響

qRT-PCR實驗結果顯示，與Control組相比，Model組自噬相關Beclin 1、LC3B mRNA表達明顯下調(#P<0.05)。與Control組相比，H+Blank組自噬相關Beclin 1、LC3B mRNA表達無明顯變化(P>0.05)；與Model組相比，H+LWDH組自噬相關Beclin 1、LC3B mRNA表達明顯上調(#P<0.05)；且與H+LWDH組相比，LWDH+3-MA組自噬相關基因Beclin 1、LC3B mRNA表達明顯下調(▲P<0.05)。見圖4。

圖4 qRT-PCR檢測Beclin 1、LC3B mRNA表達情況Fig.4 qRT-PCR detection of Beclin 1 and LC3B mRNA expression注：與Control組相比，#P<0.05；與Model組相比，*P<0.05；與H+LWDH組相比，▲P<0.05。

2.5 六味地黃丸含藥血清對自噬相關蛋白表達的影響

蛋白印跡法實驗結果顯示，與Control組相比，Model組自噬相關蛋白Beclin 1表達明顯下調(#P<0.05)、LC3Ⅱ/Ⅰ比值降低(#P<0.05)。與Control組相比，H+Blank組自噬相關蛋白Beclin 1表達及LC3Ⅱ/Ⅰ比值無明顯變化(P>0.05)；與Model組相比，H+LWDH組自噬相關蛋白Beclin 1表達明顯上調(#P<0.05)、LC3Ⅱ/Ⅰ比值增高(#P<0.05)；且與H+LWDH組相比，LWDH+3-MA組自噬相關蛋白Beclin 1表達明顯下調(▲P<0.05)、LC3Ⅱ/Ⅰ比值有降低趨勢，差異無統計學意義。說明在氧化應激條件下成骨細胞自噬水平降低，而LWDH含藥血清可以促進氧化應激狀態下成骨細胞的自噬水平。見圖5。

圖5 蛋白印跡法檢測Beclin 1、LC3B 蛋白表達情況Fig.5 Western blotting assay for Beclin 1 and LC3B protein expression注：A：Control組；B：Model組；C：H+Blank組；D：H+LWDH組；E：LWDH+3-MA組。與Control組相比，#P<0.05；與Model組相比，*P<0.05；與H+LWDH組相比，▲P<0.05。

3 討論

研究發現[13]，絕經期女性由于年齡的增長，機體的雌激素水平會逐漸降低、抗氧化能力減弱、氧化酶活性增加，最終會誘導機體發生氧化應激反應。機體內ROS不斷堆積，會對胞膜及胞核中的脂質、蛋白質和DNA等物質造成損傷，這不僅會使成骨細胞的活性降低，還會導致成骨細胞凋亡增多，最終導致骨代謝的失衡、骨密度的降低[14-15]。本研究發現，H2O2會明顯提高MC3T3-E1成骨細胞的ROS水平，可模擬細胞處于氧化應激狀態，且對細胞增殖具有明顯的抑制作用；而六味地黃丸含藥血清可以降低氧化應激狀態下細胞內ROS水平，減輕細胞氧化損傷，以促進細胞的增殖。

研究顯示[16]，在多種毒性條件下，如氧化應激狀態下，自噬對成骨細胞都具有保護作用，并且深度參與了體內多種生物信號介導的成骨分化[17]。目前的研究證明[18-19]，氧化應激和自噬之間具有復雜的相互作用關系，機體內過多的ROS能誘導自噬發生，而細胞自噬的激活，可以通過降解胞內受損的細胞器、蛋白質等來降低機體的ROS水平，以調節氧化/抗氧化平衡。影響細胞自噬發生過程最關鍵的是自噬小體的形成，同時也受到很多自噬相關基因，比如LC3、Beclin 1等的調控。其中LC3有兩種亞型，當激活細胞自噬后，LC3-Ⅰ型會迅速轉換成LC3-Ⅱ型，因此機體內LC3-Ⅱ的表達量可以作為自噬小體形成的標志之一[20]。Beclin l可以通過與分隔膜結合形成成熟的自噬小體[21]，因此Beclin l的表達水平與自噬水平呈正相關，被認為是自噬的正向調節因子，若Beclin l的表達增多，則可以說明自噬被激活。本研究發現，H2O2會降低成骨細胞Beclin 1、LC3B mRNA的表達、降低Beclin 1蛋白表達及LC3Ⅱ/Ⅰ比值；而六味地黃丸含藥血清可以提高氧化應激狀態下成骨細胞Beclin 1、LC3B mRNA的表達、提高Beclin 1蛋白表達及LC3Ⅱ/Ⅰ比值，且在加入自噬抑制劑3-MA后，該作用被抑制。說明六味地黃丸含藥血清減輕氧化應激狀態下的MC3T3-E1成骨細胞的氧化損傷的機制可能是誘導細胞自噬。

綜上所述，六味地黃丸含藥血清減輕MC3T3-E1成骨細胞的氧化應激損傷以促進細胞的增殖，可能是通過誘導細胞自噬來實現的。目前研究發現[22-24]，細胞自噬具有雙重作用，在正常生理狀態下細胞保持著基礎水平的自噬，當氧化應激程度超過機體的可控范圍時，無法被清除的ROS會激活自噬的相關通路使自噬過度，以出現細胞自我消化現象，最終導致細胞死亡，這被稱為依賴ROS的自噬性死亡途徑，目前該死亡途徑在眾多腫瘤細胞系中已得到證實。六味地黃丸如何調控成骨細胞自噬處于可控范圍內，以抵抗細胞的氧化應激損傷還需要進一步研究。