抗菌肽MAF-1A洐生肽的設計及其抗白色念珠菌活性*

黃敏慧， 曾曄， 張迎春， 李彩多， 吳建偉， 陳崢宏*， 王濤*

(1.貴州醫科大學 基礎醫學院， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省普通高等學校病原生物學特色重點實驗室， 貴州 貴陽 550025)

近年來，白色念珠菌(Candidaalbicans，C.albicans)感染的臨床病例數逐年上升，由C.albicans所致的侵襲性真菌病的死亡率高達50%[1-3]。隨著抗真菌藥物的廣泛使用，真菌的耐藥現象越來越普遍，耐藥性已成為當前臨床抗真菌感染治療中亟待解決的難題?？咕?antimicrobial peptides, AMPs)是一種小分子先天免疫功能多肽，對真菌、細菌、病毒等病原微生物和腫瘤細胞具有抑殺活性，且不易產生耐藥等特點，具備開發成為新型抗菌藥物的巨大潛力[4-6]。家蠅抗真菌肽-1A(Muscadomesticaantifungal peptide-1A，MAF-1A)是本課題組從家蠅幼蟲獲得的由26個氨基酸殘基構成的小分子陽離子多肽[7]，研究表明MAF-1A對C.albicans等多種真菌及腫瘤細胞具有良好的抑殺效果[8-10]，具有新型肽類藥物開發潛力，但其抗菌能力、溶血性等需要進一步優化。研究表明，一些天然AMPs經結構改造后具有與模板肽相似或更高的生物學活性[11-12]。因此，本研究采用序列截短法、氨基酸殘基替換法對MAF-1A進行改造，利用生物信息學分析衍生肽的結構、理化性質，并檢測其抗C.albicans生物學活性及抗菌機制，以期獲得高抗菌活性、低毒性的AMPs，為臨床新型抗真菌藥物研發提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1受試菌株C.albicansATCC10231由貴州醫科大學病原生物學特色重點實驗室保存。

1.1.2主要試劑和儀器 沙氏葡萄糖肉湯培養基(schaller's glucose broth, SDB；杭州百思)、沙氏葡萄糖瓊脂培養基(sabouraud dextrose agar, SDA；杭州百思)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS；北京Solarbio)、Triton X-100(北京Solarbio)、2.5%戊二醛(北京Solarbio)、氟康唑(fluconazole, FLC；北京Solarbio)；單面垂直流超凈工作臺(蘇州SW-CJ-1F)、超微量微孔板分光光度計(美國biotek epoch2)、臺式高速冷凍離心機(德國SIGMA)。

1.2 研究方法

1.2.1MAF-1A衍生肽的分子設計、生物信息學分析及化學合成 根據影響AMPs功能的正電荷、疏水性、兩親性及a-螺旋結構等參數，對MAF-1A進行分子改造。首從采用截短法從MAF-1A的 N端以及C端分別截取2、3、4或5個氨基酸得到4條截短肽，其次用堿性氨基酸-賴氨酸(lysine,K)替換截短肽序列中的谷氨酸(glutamic acid,E)、天冬酰胺(aspartic acid,D)和絲氨酸(serine,S)，以此來增加正電荷；異亮氨酸(isoleucine, I)、色氨酸(tryptophan,W)替換谷氨酰胺(glutamin,Q)和E提高衍生肽的疏水性；利用ProtParam網站軟件 (https://web.expasy.org/protparam/)預測AMPs的理化性質；以HeliQuest網站軟件(https://heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgi-bin/ ComputParams.py) 預測AMPs的螺旋輪投影；使用NPS (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl/page=/NPSA/npsa. html) 網站的HNN軟件計算AMPs中α-螺旋所占比例。所設計的衍生肽通過生物信息學的方法分析，篩選出理化性狀優秀的多肽委托生工生物(上海)工程股份有限采用9-芴甲氧羰基固相合成法合成，高效液相色譜純化、液相色譜-質譜驗證，多肽合成純度≥98%。

1.2.2衍生肽抗C.albicans活性檢測 參考美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推薦的M27-A3方法，挑取對數生長期的C.albicansATCC10231菌落置于SDB液體培養基中，并采用細胞計數板進行計數、將菌液濃度調整至(0.5～2.5)×106cfu/L。取相同體積的菌液100 μL分別與4條不同終濃度(25～1 600 mg/L)的衍生肽稀釋液于96孔板中混勻，37 ℃孵育24 h，肉眼觀察無菌生長孔對應的濃度為衍生肽的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)。取MIC 試驗中判定無菌生長的培養液接種于SDA 平板，37 ℃培養24 h，觀察平板上菌落生長現象，以無菌生長所對應的最低藥物濃度為最小殺真菌濃度(minimum fungicidal concentration, MFC)，另設MAF-1A 組(25～1 600 mg/L MAF-1A處理)、FLC對照組(0.25～64.00 mg/L FLC處理)，每組實驗重復3 次。

1.2.3衍生肽溶血活性檢測 采集健康人全血，離心分層后吸取下層的血細胞，并重懸于PBS中得到4%(V/V)紅細胞懸液備用。取重懸紅細胞100 μL分別與不同終濃度的4條活性衍生肽和模板肽MAF-1A(25～400 mg/L)稀釋液100 μL混勻于96孔板中，0.1%Triton X-l00處理組作為陽性對照，PBS處理組作為陰性對照。恒溫37 ℃孵育2 h，96孔板4 ℃于1 500 r/min離心10 min，取上清液100 μL使用酶標儀于波長414 nm處測其吸光度并計算溶血率，實驗重復3次。

1.2.4活性衍生肽對C.albicans的殺菌動力學檢測 取濃度為(1.0～5.0)×109cfu/ L菌液與不同終濃度(1、2、4×MIC)的活性衍生肽稀釋液混合，37 ℃恒溫培養；分別在0、4、8、12、16、20、24 h取菌液100 μL適當稀釋，劃線涂布于SDA平板上，37 ℃恒溫培養24 h，菌落計數。以不同時間點(h)為橫坐標，菌落數的對數 (log cfu/L)為縱坐標，繪制時間-殺菌曲線。同時設MAF-1A組(1、2、4×MIC MAF-1A 處理)、FLC對照組(1、2、4×MIC FLC 處理)和陰性對照組(PBS處理)，每組實驗重復 3 次。

1.2.5C.albicans細胞樣品制備與掃描電鏟觀察 制備濃度為1.0×109cfu/L的C.albicans菌液，加不同終濃度(1、2、4×MIC)的活性衍生肽稀釋液，37 ℃培養12 h，3 000 r/min離心2 min收集沉淀，PBS洗滌3次，棄上清，加2.5%戊二醛固定3 h，PBS洗滌3次，依次于50%、75%及100%乙醇中各脫水5 min，取沉淀涂于載玻片，干燥后用離子濺射儀噴金，掃描電鏡觀察其形態。另設MAF-1A組(1、2、4×MIC MAF-1A 處理)、FLC對照組(1、2、4×MIC FLC 處理)和陰性對照組(PBS處理)。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 MAF-1A 和衍生肽的生物信息學

通過生物信息學方法分析、篩選出4條衍生肽(表1)：MAF-1A22S3、MAF-1A20S3、MAF-1A18S5和MAF-1A16S5，與模板肽MAF-1A相比，4條衍生肽的序列長度明顯減短，分別由22、20、18和16個氨基酸組成，相對分子量有所降低；用帶正電荷的氨基酸以及疏水性的氨基酸替換后，MAF-1A22S3和MAF-1A18S5的正電荷數均由+2增加到+7，MAF-1A20S3和MAF-1A16S5分別增加到+8和+5；疏水性分別由0.013增加到0.478、0.326、0.461和0.671，MAF-1A22S3和MAF-1A16S5結構中的的α-螺旋占比有所增加，不穩定指數均降低(表2)。螺旋輪結構分析結果可見(圖1)，衍生肽和MAF-1A均為兩親性結構。

表1 MAF-1A和衍生肽的序列Tab.1 Sequence of MAF-1A and derived peptides

表2 MAF-1A和衍生肽理化性質參數Tab.2 Physicochemical properties of MAF-1A and derived peptides

注：黃色表示強疏水性氨基酸，灰色表示弱疏水性氨基酸，藍色表示帶正電的親水性氨基酸氨基，紅色表示帶負電的氨基酸殘基，紫色表示不帶電的氨基酸殘基。圖1 MAF-1A和衍生肽的螺旋輪結構Fig.1 Helical wheel projection of MAF-1A and derived peptides

2.2 MAF-1A衍生肽對C.albicans的抗菌活性

體外抗C.albicans活性檢測結果顯示(表3)，衍生肽MAF-1A22S3、MAF-1A20S3、MAF-1A18S5及MAF-1A16S5對C.albicans均具有抗菌活性，相較于模板肽MAF-1A，4條衍生肽的MIC和MFC值均下降，其中MAF-1A22S3的抗菌活性增加最為明顯(MIC為31.25 mg/L、MFC為125.00 mg/L)，優于模板肽MAF-1A。

表3 MAF-1A、衍生肽和FLC對C.albicans的MIC和MFCTab.3 MIC and MFC of MAF-1A, derived peptides, and FLC against C. albicans

2.3 MAF-1A衍生肽的溶血活性

體外溶血實驗結果顯示(圖2)，衍生肽MAF-1A18S5、MAF-1A16S5的溶血活性較強，而MAF-1A22S3、MAF-1A20S3溶血活性低于模板MAF-1A，其中MAF-1A22S3的溶血性最低，在200 mg/L(6×MIC)范圍內溶血率<5%，即使高于MIC 值12倍(400 mg/L)時，溶血率仍然低于 10%，僅出現輕微的溶血現象。

注：(1)與同濃度MAF-1A組比較，P<0.05。圖2 MAF-1A及其衍生肽的溶血率Fig.2 Hemolytic rate of MAF-1A and derived peptides

2.4 時間-殺菌曲線分析

時間-殺菌曲線結果顯示(圖3)，MAF-1A22S3對C.albicans具有較強的殺菌作用，濃度為1×MIC、2×MIC及4×MIC的MAF-1A22S3在作用于C.albicans后立即發揮殺菌作用，且隨濃度的增加，殺菌效率逐漸增強，當濃度為4×MIC時作用4 h后即可將C.albicans完全殺滅；相同作用濃度下，MAF-1A22S3對C.albicans的殺菌效率強于模板肽MAF-1A和FLC對照組。

注：A～C分別為藥物濃度1×MIC、2×MIC及4×MIC。圖3 MAF-1A、MAF-1A22S3和 FLC作用C.albicans后的時間-殺菌曲線Fig.3 Time-kill kinetics of MAF-1A, MAF-1A 22S3, and FLC against C. albicans

2.5 C.albicans掃描電鏡結果

掃描電鏡結果顯示(圖4)，陰性對照組C.albicans菌體呈橢圓形，細胞表面光滑，可見細長假菌絲；1×MIC的MAF-1A22S3作用12 h，C.albicans細胞壁出現明顯凹陷、裂痕，并有細胞內容物溢出；1×MIC的MAF-1A和FLC處理后，C.albicans的病變程度較輕，僅出現細胞凹陷和裂痕現象；2×MIC的MAF-1A22S3作用12 h后，細胞壁損傷嚴重，菌體明顯皺縮，出現小囊泡樣結構；4×MIC的MAF-1A22S3作用12 h后，細胞壁完全破裂，內容物大量溢出，未見形態完整細胞。

圖4 MAF-1A、MAF-1A22S3及FLC作用C.albicans后的掃描電鏡結果Fig.4 Scanning electron microscope images of C. albicans treated with MAF-1A, MAF-1A22S3, and FLC

3 討論

AMPs是生物體抵抗外界病原體感染的小分子多肽，對病原微生物和腫瘤細胞均有抑制生長或清除作用[13-15]。由于AMPs抗菌活性好，免疫原性低，不易產生耐藥性等特點，具備新型抗菌藥物開發的巨大潛力[16-17]。但是天然AMPs由于存在抗菌活性較傳統化學藥物低、存在溶血性與細胞毒性等，使其在臨床應用中受到了限制[18-20]。因此，以天然AMPs為模板進行分子改造是獲得高效、低毒新型肽類藥物的重要途徑。

目前，AMPs的改造方法有氨基酸殘基替換法、序列截短法、片段組合法以及化學基團修飾法等，其中氨基酸殘基替換法、序列截短法較為常用[21-24]。AMPs結構與功能關系的研究表明，影響AMPs抗菌活性的主要理化和結構參數包括陽離子性、疏水性、雙親性、α-螺旋結構及肽鏈長度等[25-28]。Galeane等[29]以 AMPs Mastoparan的氨基酸序列為模板，通過使用帶正電荷的賴氨酸進行替換來提高衍生肽的陽離子性，結果表明衍生肽MK58911和MK4589對于C.albicans的抑制活性明顯增強；也有研究顯示，通過肽鏈截短可以降低衍生肽的溶血性及免疫原性[30-31]。本研究在對MAF-1A理化性質分析的基礎上，采用序列截短法與氨基酸殘基替換法相結合的方式，從陽離子性、疏水性、α-螺旋及氨基酸組成等方面對 MAF-1A 進行分子改造，結果提示改造獲得的4條衍生肽MAF-1A22S3、MAF-1A18S5、MAF-1A20S3及MAF-1A16S5的正電荷數、疏水性及穩定性較MAF-1A明顯增加，且MAF-1A22S3和MAF-1A16S5的α-螺旋結構占比高于MAF-1A，表明本研究采用的分子改造方法能夠有效地優化影響AMPs抗菌活性的主要理化和結構參數，提示本研究中對模板肽的改造方法可行。

抗菌活性檢測結果顯示，4條衍生肽對C.albicans的MIC以及MFC值均小于模板肽MAF-1A，表明衍生肽對C.albicans的抑殺活性均有不同程度的提高，其中MAF-1A22S3和MAF-1A18S5的抗C.albicans活性最佳；而體外溶血實驗結果顯示，4條衍生肽中MAF-1A22S3的溶血活性最小，相同濃度下，其溶血率顯著低于MAF-1A，結果表明MAF-1A22S3是一條具有高抗菌活性，低毒性的衍生肽。時間-殺菌曲線也顯示，MAF-1A22S3在作用于C.albicans后立即發揮殺菌作用，且隨濃度的增加，殺菌效率逐漸增強，相同作用濃度下，MAF-1A22S3對C.albicans的殺菌效率強于模板肽MAF-1A和氟康唑對照組；以上結果進一步表明，MAF-1A22S3的對C.albicans的生長繁殖具有良好的抑殺活性，其抗菌活性、安全性優于模板肽，提示衍生肽MAF-1A22S3具備進一步開發為抗真菌藥物的潛力。

目前研究認為，AMPs主要通過破壞細胞表面結構(細胞壁、細胞膜)或作用于細胞內DNA/RNA、蛋白質等靶分子來發揮其抗菌作用[32-34]。掃描電鏡結果顯示，經MAF-1A22S3作用后C.albicans的細胞表面出現凹陷、裂痕等細胞病變，隨作用濃度的增加細胞病變更為明顯，最終細胞皺縮、裂解死亡，表明MAF-1A22S3可以通過破壞C.albicans細胞表面結構發揮抗菌作用，菌細胞的損傷程度與濃度呈正相關，但具體分子機理需要進一步研究。

綜上所述，通過分子改造所獲得的衍生肽MAF-1A22S3的抗真菌活性及安全性明顯提高，其可以通過破壞菌細胞的完整性發揮抗菌作用，研究結果提示，新型 AMPsMAF-1A22S3可以作為抗真菌藥物候選分子，具有深入研究價值和應用前景。