妊娠期糖尿病的關鍵基因與胎盤免疫細胞浸潤模式分析*

彭思佳， 陳寶艷， 梁靖誼， 潘兆豐， 楊云虹， 謝秋月， 孫曉峰**

(1.廣州中醫藥大學 第一臨床醫學院， 廣東 廣州 510000； 2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院 產科， 廣東 廣州 510000)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)是指妊娠后首次發生的糖代謝異常性疾病[1]。GDM的發病率逐年增加，世界發病水平為9.3%～25.5%[2]。過去各國學者在GDM的診斷方法和標準、應對哪些人群進行干預、對何種程度的糖代謝異常進行管理等問題上爭議不斷，因此美國國立衛生研究院對高血糖與妊娠不良結局關系開展了全球性多中心、前瞻性的研究，解決了長期以來備受爭議的診療標準問題。2010年國際妊娠合并糖尿病組織推薦將75 g糖耐量試驗(oral glucose tolerance test, OGTT)作為GDM診斷的工具，雖然診斷標準得到明確，但GDM的治療方式依然有限，主要通過嚴格控制飲食、加強運動及胰島素干預來達到治療目的。然而，即使GDM患者孕期血糖控制達標，仍有出現孕產期相關的母兒不良妊娠結局的可能[3]。目前GDM發病機制尚未完全明確，主要發病原因包括胰島素抵抗、脂肪細胞因子失衡、炎癥因子釋放及遺傳因素[4]，很少涉及胎盤組織的病理變化。胎盤是連接母體與胎兒的橋梁，具有物質交換、防御、合成等多種重要功能，是維持胎兒生長發育的重要器官[5-6]。有研究表明，子癇、先兆流產、妊娠高血壓綜合征及胎兒發育遲緩等疾病與胎盤結構或功能異常密切相關，但機制尚不十分明確[7]。免疫細胞浸潤模式在腫瘤方面已有大量的研究，但是在妊娠期疾病中卻鮮有報道。目前，精準醫學將現代科技與傳統醫學相結合后取得了高效精準的效果，運用基因芯片可檢測同一樣本時間點內所有基因的差異表達，對表達譜數據進行生物信息學分析，已成為研究人類疾病發病機制的重要方法之一。本研究通過對基因芯片數據庫(gene expression omnibus，GEO)中GDM孕婦和無孕期合并癥孕婦配對樣本的差異關鍵基因進行相關生物信息學分析，利用評估鑒定22種免疫細胞相對含量的CIBERSORTx算法對GDM胎盤組織免疫浸潤進行研究，預測相關免疫細胞調控方式，并收集分娩后的GDM胎盤組織和非GDM胎盤組織進行驗證，為GDM的診斷和治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 研究資料

1.1.1生物信息學資料 以“gestational diabetes mellitus”“GDM”“placenta”為關鍵詞在美國國家生物技術信息中心(national center for biotechnology information, NCBI)的GEO數據庫檢索GDM胎盤基因組樣本，結合樣品質量、納入數量等情況，最終選擇數據集GSE70493作為本研究的目標數據集，該數據集包含從32例GDM病例和31例無孕產期并發癥的妊娠婦女分娩后收集的共63個胎盤組織標本資料。

1.1.2胎盤組織 收集GDM患者和非GDM患者的胎盤組織各3例，每塊組織約0.5 cm×1 cm。將組織塊置入無RNA酶的EP管內，用剪刀剪成碎塊用于生物信息學結果的驗證。

1.2 研究方法

1.2.1差異基因分析 使用GEO數據庫中的在線分析工具GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)對所研究數據集進行分析，以矯正P<0.01，|logFC≥1|的標準篩選出差異基因(DEGs)，正值與負值分別代表上調和下調。導出數據后在GEO數據庫中檢索對應測序平臺GLP17586(Affymetrix Human Transcriptome Array 2.0)的注釋文件，下載并整理格式后對獲得的差異基因進行注釋，以便進行下一步分析。將注釋后的DEGs導入R語言(版本3.6.2)，調取ggplot2包繪制差異基因火山圖。

1.2.2基因本體(gene ontology，GO)功能及KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析 為了評估DEGs的功能及所富集的通路，將注釋后的DEGs名稱上傳至DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)，使用該網站的基因ID(Identity Document)轉換工具(Gene ID Conversion Tool，https://david.ncifcrf.gov/conversion.jsp)將DEGs名稱轉換為標準基因名(official gene symbol)，然后將轉換后的基因名上傳至Metascape數據庫(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)，限定物種為H species，分析DEGs中生物過程(biological processes, BP)、細胞成分(cellular components, CC)和分子功能(molecular functions, MF)類別中富集的GO項和KEGG通路，最后以P<0.05為閾值對所得到的超幾何分布進行篩選。

1.2.3構建蛋白相互作用網絡(protein-protein interaction，PPI) 利用蛋白相互作用檢索工具STRING數據庫(ver.11.5，https://string-db.org/)分析DEGs與其他基因之間的功能相互作用。將DEGs上傳至STRING數據庫，設置置信度評分閾值為>0.4進行分析計算，下載分析完成的網絡模型，將數據導入Cytoscape(版本號3.9.0，http://www.cytoscape.org/)中繪制PPI網絡圖。使用Cytoscape中的CentiScaPe(版本號2.2)工具分析PPI網絡的拓撲結構，根據自由度(貢獻度)≥均值的標準選擇后續分析基因，分別根據自由度和中介中心性數值由大到小對所有節點進行排序，篩選出各組中排名前10位的差異基因，并在其中挑選出同時滿足自由度和中介中心性值都在前10位的基因作為關鍵差異基因。

1.2.4胎盤免疫細胞浸潤模式的評估 利用基于547個條形碼基因表達值對樣品中22個免疫細胞比例進行估計的CIBERSORTx反卷積算法工具(https://cibersortx.stanford.edu/)對人類免疫細胞亞型表達矩陣進行去卷積分析，模擬計算出數據集樣品中包括T細胞、原始和記憶B細胞、靜止和活化NK細胞(natural killer cell)在內的22種免疫細胞的轉錄特征矩陣，計算次數設置為100次。將計算結果導入R語言中，利用R語言中的ggplo2包和Bioconductor(https://www.bioconductor.org/)包進行統計分析并繪制兩組樣本中每種免疫細胞的表達豐度熱圖、對比條狀圖及箱線圖。

1.2.5逆轉錄實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法對GDM胎盤組織關鍵差異基因的驗證 用TRIzol試劑(Invitrogen，美國)提取2種胎盤組織的總RNA。取總RNA 1 μg，使用逆轉錄試劑盒(艾科瑞生物，中國)將總RNA逆轉錄為cDNA。按照SYBR Green PCR試劑盒(艾科瑞生物，中國)說明配置含cDNA、引物、SYBR的混合體系，在Bio-Rad CFX96 PCR儀中完成PCR擴增。反應條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 40 s共40個循環，65 ℃ 5 s，0.5 ℃ 60 s。使用β-actin作為內參照，使用2-ΔΔCt法計算2種胎盤組織的基因補體C3 (complement 3，C3)、人類白細胞抗原B(major histocompatibility complex class I B，HLA-B)、HLA-C、C-X-C基序趨化因子10(C-X-C motif chemokine ligand 10，CXCL10) mRNA的相對表達水平。引物序列見表1。

表1 C3、CXCL10、HLA-B及HLA-C基因的PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences for C3, CXCL10, HLA-B, and HLA-C genes

1.2.6Western blot法對GDM胎盤組織關鍵差異蛋白的驗證 取胎盤組織碎塊，加入適量RIPA裂解液(碧云天，中國)，4 ℃下使用勻漿15 s，置于冰上裂解20 min， 4 ℃、14 000 r/min離心10 min，吸取上清，用BCA蛋白濃度檢測試劑盒(Biosharp，中國)檢測蛋白濃度；使用小型垂直凝膠蛋白電泳系統(Bio-Red，美國)分離總蛋白至聚偏二氟乙烯膜(MILLIPORE，美國)，洗膜、一抗(艾比瑪特生物科技，中國)孵育、過夜，化學發光法顯色。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 GDM關鍵DEGs分析

通過對GEO數據庫中數據集的檢索篩選，得到GDM胎盤基因表達譜測序數據集GSE70493，收集到32例GDM病例及31例無孕產期并發癥的妊娠婦女分娩后共63個胎盤組織數據；利用基于limma包構建的在線分析工具GEO2R對數據集GSE70493進行分析，剔除映射多個基因的探針數據，保留具有獨特基因的探針，最終篩選出207個DEGs，其中包括60個上調基因和147個下調基因，根據注釋文件對這些DEGs進行注釋。將分析后的DEGs數據導入R中用于數據可視化分析，調用gglop2包繪制火山圖(圖1)。

注：圖中每個紅點代表一個P<0.05的上調DFG，每個藍點代表1個P<0.05的下調DEG，灰點代表無顯著差異基因。圖1 GDM關鍵DEGs分析Fig.1 Analysis of key DEGs in GDM

2.2 GDM關鍵DEGs的PPI網絡分析

經STRING工具分析并由Cytoscape繪制得到的PPI網絡中，共有105個節點和235個基因對。通過CentiScaPe工具分析得到PPI網絡拓撲結構中各節點信息，計算出自由度值均值為4.74，符合自由度值≥4.74的基因共有39個，占所有節點的37.1%，根據自由度值及中介中心性值分別篩選前10位的節點(表2)。結果顯示，C3、HLA-B、HLA-C及CXCL10在自由度及中介中心性中均在前10位以內，表明其在PPI中的重要程度較高。

表2 自由度值和中介中心性值排名前10的差異基因列表Tab.2 Top 10 DEGs rankey by degree and betweenness

2.3 GO功能富集分析與KEGG通路分析

使用Metascape數據庫對DEGs進行GO功能富集分析后，共獲得富集的生物進程20條，主要富集于免疫效應(immune response)、機體防御反應(regulation of immune response)、免疫反應分子介質生成與釋放(production of molecular mediator of immune response)、白細胞分化(leukocyte differentiation)、體液免疫反應(humoral immune response)、免疫系統負向調節(negative regulation of immune system process)、MAPK級聯調控(regulation of MAPK cascade)等；獲得富集的細胞組成11種，主要分布在細胞膜外(side of membrane)、吞噬泡(lytic vacuole)、受體相關復合物(receptor complex)、主要組織相容性復合體蛋白復合物(MHC protein complex)、液泡膜(secretory granule membrane)等；獲得分子功能11種，主要涉及抗原結合(antigen binding)、泛素樣蛋白連接酶結合(ubiquitin-like protein ligase binding)、細胞外基質結構成分(extracellular matrix structural constituent)、免疫受體活化(immune receptor activity)、CXCR3趨化因子受體結合(CXCR3 chemokine receptor binding)等。通過KEGG通路富集分析，根據p值確定排名前20的信號通路，主要包括同種異體移植排斥通路(cytokine-cytokine receptor interaction)、移植無抗宿主病(graft-versus-host disease)、Ⅰ型糖尿病(type Ⅰ diabetes mellitus)、自身免疫性甲狀腺疾病(autoimmune thyroid disease)、抗原加工和呈遞(chemokine signaling pathway)、細胞黏附分子(cell adhesion molecules, CAMs)以及Toll樣受體信號通路(toll-like receptor signaling pathway)。見圖2。

注：A為GO功能富集結果，B為KEGG通路結果，B中網格圖中橫軸為富集系數，縱軸為KEGG富集通路名稱，點狀標記的直徑越大代表富集的基因數量越多，顏色越接近橙色代表顯著性越高，越接近藍色代表顯著性越低。直條圖中橫軸為生物進程(綠色)/細胞組成(橙色)/分子功能(紫色)的名稱，縱軸為富集系數。圖2 GDM關鍵DEGs的KEGG及GO分析結果Fig.2 Results of KEGG and GO analysis about key DEGs of GDM

2.4 胎盤免疫細胞浸潤模式分析

從PPI、GO功能富集分析與KEGG通路分析中可以發現，免疫相關基因及免疫相關通路在GDM妊娠孕婦與非GDM妊娠孕婦胎盤組織中有明顯的差異。為了更深入探究GDM的病理變化，進一步分析胎盤組織中的免疫環境、探究免疫相關通路可能的作用機制。首先，對樣品進行了22種免疫細胞的浸潤模式分析，以尋找最主要的差異免疫細胞；然后，將2組樣本的免疫細胞組成進行了比較，繪制各樣品免疫細胞占比熱圖(圖3)。分析的結果顯示，GDM樣品中單核細胞的浸潤豐度明顯低于非GDM樣品(P<0.05)，而GDM樣品中M2巨噬細胞的浸潤豐度較高(P<0.05)；免疫細胞比例箱圖(圖4A)中更直觀地展示了各樣品的22種免疫細胞的浸潤比例，并進行對比分析(圖4B)。

注：圖中橫軸為樣品編號(紅點標注的樣品為GDM胎盤組織)，縱軸為免疫細胞類型，網格中顏色越接近紅色代表該種細胞在該樣品中占比越高。圖3 各樣品的22種免疫細胞占比熱圖Fig.3 Heat map of the proportion of 22 kinds of immune cells in each sample

注：圖A中橫軸為樣品名稱(紅點標注的樣品為GDM胎盤組織)，縱軸為所占比例，不同顏色的色塊代表不同細胞，色塊越長代表該種細胞在該樣品中占比越高;圖B中橫軸位子細胞類型，縱軸為占比，綠色為GDM樣品，紅色為無孕產期并發癥的孕婦胎盤組織樣品；(1)表示2組間比較P <0.05。圖4 22種免疫細胞的樣品間及組間對比結果Fig.4 Comparison among samples of 22 kinds of immune cells

2.5 GDM胎盤關鍵DEGs驗證

結果顯示，與Control組比較，GDM組孕婦分娩后胎盤組織中C3、CXCL10、HLA-B、HLA-C mRNA表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)；Western blot結果反映出蛋白質表達水平，其結果與qRT-PCR趨勢基本一致(圖5)。

注： A、B、C、D分別為C3、CXCL10、HLA-B、HLA-C mRNA相對表達結果，E為顯影后的Western blot條帶， F為蛋白定量結果；(1)與Control組相比， P<0.05。圖5 4個DEGs在胎盤組織中mRNA 和蛋白表達水平驗證Fig.5 Expression levels of mRNA and protein of 4 key genes in placental tissues

3 討論

妊娠期女性是一個特殊的群體，妊娠和分娩不僅給女性身體帶來沉重的負擔，更使她們承受著巨大的心理壓力。近年來，隨著經濟水平的提高、二胎政策的開放、健康知識的普及，政府和社會將更多的目光投向優生優育，希望達到早發現、早診斷和早治療的目的。

目前，GDM的發病率還處于逐年上升的趨勢。有研究表明，GDM對母兒危害極大，GDM孕婦可能發生孕早期自然流產、并發妊娠期高血壓疾病、霉菌性陰道炎、合并感染、羊水過多等異常妊娠情況。

在本研究中，利用GEO數據庫中的數據集信息，分析篩選出GDM胎盤組織中的DEGs，并進行PPI網絡分析，根據自由度值及中介中心性值確定了其中關鍵的4個基因C3、HLA-B、HLA-C、CXCL10，通過對DEGs所富集的通路或生物進程進行分析，發現免疫相關通路在GDM胎盤中可能起著關鍵作用。進一步進行了免疫細胞浸潤分析后發現單核細胞及M2巨噬細胞是GDM胎盤中的主要差異免疫細胞。

補體C3是進化上高度保守的免疫介質，在補體級聯反應的中處于核心地位。有活性的補體C3是人類1型T輔助細胞(Th1)和細胞毒性T細胞反應過程中不可或缺的一部分[8]，細胞內C3的表達量與自身免疫反應的激活程度呈明顯的正相關關系，細胞內C3有望成為反映自身免疫嚴重程度的可靠生物標志物[9]。在糖尿病領域，已有研究表明C3被激活后的活性成分C3a具有促進胰島素分泌的功能[10]。此外，C3可以在致糖尿病條件下維持細胞的保護性自噬并防止胰島β細胞死亡[11]，高血糖情況下，C3的表達與體質量指數(BMI)呈正相關[12]。一項前瞻性的研究發現血中C3濃度與糖耐量異常程度、血糖上升水平均呈顯著的正相關。但有趣的是，本研究發現，補體C3在GDM胎盤中呈現低表達狀態，這意味著胎盤在高血糖的影響下有可能通過減少C3的合成從而影響血液中血糖含量，但具體的機制尚不清楚。

HLA-B、HLA-C均屬于人類白細胞抗原(HLA)，是人類的主要組織相容性復合體(MHC)基因的一部分[13]。雖然傳統上認為胎盤充當著母親和后代之間的較為穩定的屏障，但有研究表明，胎盤通過侵入子宮的血管進入母體血液循環后，可以通過多種途徑導致胎兒或胎盤成分在母體血液中廣泛傳播并沉積在母體組織[14]，在懷孕期間發生同種免疫[15]，而妊娠同種免疫的結果是形成抗HLA抗體，并較為穩定地存在數十年[16]。有研究者發現HLA基因的改變似乎在2型糖尿病中也起著十分重要的作用，HLA Ⅱ類變異將增加GDM的易感性[17-18]。有證據表明，HLA參與調控IL-6、IL-8、CRP、補體家族的轉錄和釋放，本研究發現HLA與GDM相關聯，在GDM孕婦胎盤組織中呈現下降趨勢，這可能是鏈接母嬰間免疫反應的重要一環。

CXCL10是一種促炎趨化因子，具有促進炎癥物質釋放和抗血管生成特性[19]。CXCL10是胰島損傷中的一種重要細胞因子[20]，能夠通過TLR4信號傳導損害糖尿病患者的β細胞功能和活力，同時誘發胰島炎，加速糖尿病的進展[21]。由于CXCL10抗血管生成的特性，在妊娠子癇中已有廣泛的研究，但有趣的是，CXCL10含量與血清瘦素水平呈正相關[22]，本研究則發現，GDM胎盤組織中CXCL10的含量較正常組織低，這意味著CXCL10可能是GDM進展中的一種保護因素。

在分析DEGs的同時，本研究發現免疫調節可能是GDM發展中的重要影響因素，免疫細胞浸潤或許起到了直接作用。根據既往的研究，妊娠實際上是一種免疫增強狀態，胎盤內含有大量免疫細胞，而免疫細胞具有合成和釋放免疫介質、抗原呈遞等一系列重要作用，是眾多免疫反應的最終執行者。巨噬細胞參與吞噬作用、先天性和適應性免疫[23]，其又可分出M1群和M2群，M1巨噬細胞具有殺菌和促炎趨化作用，M2噬細胞具有免疫調節作用，可誘導耐受和炎癥消退。有研究者提出，這2個群體可能是兩極分化的極端，巨噬細胞可能會根據環境主動轉換其表型[24]。蛻膜中的巨噬細胞還積極參與妊娠早期的滋養層侵襲、組織和血管重塑[25]，因此，巨噬細胞的功能異常將嚴重影響正常血運系統的構建，與子癇前期、自發性流產和絨毛膜羊膜炎等妊娠疾病密切相關。本研究通過比較GDM胎盤組織與正常組織的免疫細胞浸潤模式，發現單核細胞在GDM樣品中的占比顯著降低，而M2巨噬細胞的占比則剛好相反，結合富集分析及PPI網絡分析結果，提示單核細胞-巨噬細胞系統有可能是GDM胎盤免疫調節的主要參與者。

本研究也存在著一些不足。由于GDM引起的糖耐量受損將引發全身的代謝改變，從胎盤組織中進行分析的結果可能會與血清學檢查結果不能完全吻合。此外，本研究涉及的樣本為分娩胎盤組織，其結果不能反映妊娠過程中的動態變化。

綜上所述，本研究發現了GDM胎盤變化的四個關鍵基因(C3、HLA-B、HLA-C、CXCL10)且均與免疫反應密切相關，進一步研究發現單核細胞-巨噬細胞系統與GDM有密切的聯系，可能是導致GDM胎盤變化的主要執行者，這些結果為研究GDM的發病機制及探索新的治療方案提供了新的觀點。