藍刺頭提取物對骨質疏松癥模型大鼠的改善作用及代謝機制 Δ

董 馨 ，王佳琪 ，張秀艷 ，張仲堯 ，陸景坤 ，高建萍 ，薛培鳳 （.內蒙古醫科大學藥學院，呼和浩特 000；.呼和浩特市蒙醫中醫醫院藥劑科，呼和浩特 00000；.內蒙古醫科大學基礎醫學院，呼和浩特 0000）

骨質疏松癥是一種骨代謝性疾病，多發于老年人與絕經后婦女，臨床表現為骨微結構退化和骨密度降低，進而增加骨脆性，誘發骨骼變形、骨折、骨骼疼痛以及多臟器損傷等并發癥[1]。而隨著人口老齡化加劇，骨質疏松癥的發病率已居慢性病第三位[2]。據相關調查顯示，我國60歲以上人群骨質疏松癥患病率達到36.0%，預計至2050年，我國骨質疏松癥患者將達到2.02億人[3]。而現有的骨質疏松癥治療藥物存在副作用大、價格昂貴、患者依從性差等問題[4]。因此，積極開展對老年性骨質疏松癥的預防與治療，研發安全、有效、經濟的抗骨質疏松新藥意義重大。

蒙藥藍刺頭Echinops sphaerocephalus Linn.為菊科多年生草本植物，具有接骨愈傷、壯骨之功效[5]。本課題組前期已對藍刺頭中化學成分及其對去勢大鼠骨代謝、細胞因子的調控作用進行了初步研究，證實了藍刺頭提取物具有類雌激素樣作用，能夠有效防治絕經后期骨質疏松癥[6―7]。但目前有關藍刺頭對D-半乳糖誘導的骨質疏松癥是否有效，且如何起效尚不明確。本研究通過經典藥理學指標研究藍刺頭對D-半乳糖誘導的骨質疏松癥模型大鼠的療效；同時借助代謝組學技術優勢，探究大鼠的代謝變化，并通過差異代謝物與代謝通路分析探討其代謝機制，以期為藍刺頭防治骨質疏松癥提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Q-ExactiveTM組合型四極桿OrbitrapTM質譜儀、Ultimate 3000型高效液相色譜系統（美國Thermo Fisher Scientific公司），Milli-Q iq7000型超純水系統（德國Merk公司），5424R型離心機（德國Eppendorf公司），EYELAN-1100型旋轉蒸發器（上海愛朗儀器有限公司），Forma 900 Series型超低溫冰箱（美國Thermo Scientific公司），Inveon MM型小動物正電子發射斷層顯像/X線計算機體層成像儀（positron emission tomography/computedtomography，PET/CT；德國Siemens公司），Spectra Max i3x型酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]。

1.2 主要藥品與試劑

丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAOC）檢測試劑盒均購自武漢華聯科生物技術有限公司，批號分別為ab119611、ab65445、GR201812-1、GR201833-3、ab118194；生理鹽水（批號210803）、D-半乳糖（批號CG29133740）均購自呼和浩特市澤浩生物科技有限責任公司；骨疏康顆粒（陽性對照藥，批號151002332，每袋裝10 g）購自遼寧沃華康辰藥業有限公司；液質聯用級乙腈、甲酸均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。藍刺頭藥材于2020年8月采集自內蒙古武川縣，經內蒙古醫科大學藥學院生藥學教研室渠弼副教授鑒定為真品。

1.3 實驗動物

雄性Wistar大鼠36只，體質量（200±20）g，12周齡，購自內蒙古醫科大學實驗動物研究中心，生產許可證號為SCXK（蒙）2015-0001。大鼠飼養于標準受控環境（相對濕度50%～60%，溫度18～22 ℃，12 h晝夜交替，自由進食飲水）。動物實驗經內蒙古醫科大學醫學倫理委員會批準（批準號為YKD2018056）。所有大鼠飼養1周后進行實驗。

2 方法

2.1 藥液的制備

取500 g 藍刺頭藥材，加入6 000 mL蒸餾水，加熱回流提取2次，每次30 min。將2次濾液合并，濃縮、凍干后得藍刺頭提取物凍干粉，經紫外分光光度法[8]測得其總酚酸含量為63.03 mg/g，于－20 ℃保存備用。使用時加入適量蒸餾水溶解得質量濃度為21 mg/mL的藍刺頭凍干粉藥液（以藍刺頭提取物計）；同時使用適量蒸餾水溶解骨疏康顆粒，得質量濃度為10.5 mg/mL的藥液。

2.2 動物分組、造模與給藥

采用數字隨機分組法將36只大鼠分為6組，分別為空白組、模型組、骨疏康組和藍刺頭高、中、低劑量組，每組6只。空白組按5 mL/kg腹腔注射生理鹽水，其余各組按120 mg/kg腹腔注射D-半乳糖，持續注射8周，建立骨質疏松癥模型[9]。建模后，藍刺頭高、中、低劑量組分別按878、439、219.5 mg/kg（分別為臨床等效劑量的4、2、1倍）灌胃藍刺頭凍干粉藥液；骨疏康組按105.1 mg/kg（劑量為臨床等效劑量）灌胃骨疏康藥液；空白組與模型組灌胃等體積生理鹽水。每日1次，連續給藥8周。

2.3 取材

各組大鼠末次給藥后，連續12 h禁食不禁水，然后麻醉，腹主動脈取血，置于5 mL采血管中，3 500 r/min離心10 min后分離血清，置于－80 ℃保存備用。將大鼠取血后處死，取右側脛骨，剔除肌肉，用生理鹽水沖洗干凈，以保鮮膜和錫紙包裹后，分裝在密封袋中并標記，置于－80 ℃保存備用。

2.4 血清中骨代謝與氧化應激指標含量的檢測

采用酶聯免疫吸附測定法，參照試劑盒說明書檢測血清中骨代謝指標（HYP、ALP）及氧化應激指標（TAOC、SOD、MDA）的含量。

2.5 骨微結構的檢測

采用PET/CT掃描各組大鼠右側脛骨，并使用micro-CT骨分析軟件進行分析，評價各組大鼠右側脛骨密度（bone mineral density，BMD）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb·Th）、骨小梁數量（trabecular number，Tb·N）、骨小梁間距（trabecular separation，Tb·Sp）。同時在感興趣區域圖像中測量脛骨中軸處皮質骨的骨體積分數（bone volume fraction，BVF）、骨表面積/骨體積比值（bone surface/bone volume，BS/BV）。

2.6 代謝組學研究

2.6.1 溶液的制備 （1）樣本溶液：取出凍存的各組大鼠血清，于4 ℃下解凍。取200 μL血清樣品，采用3倍體積甲醇進行蛋白沉淀。將血清與甲醇混合物渦旋5 min，于4 ℃下14 000 r/min離心10 min；隨后取上清液，減壓離心、濃縮干燥后，用100 μL甲醇復溶，渦旋5 min，14 000 r/min離心10 min，取上清液置于進樣瓶中備用。（2）質量控制（quality control，QC）樣本溶液：另分別吸取所有血清樣本各10 μL混合為QC樣本，處理方法同“2.6.1（1）”項下，取上清液置于進樣瓶中備用。

2.6.2 色譜條件與質譜條件 （1）色譜條件：以Thermo Hypersil PFP（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）為色譜柱進行分離，以0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）為流動相進行梯度洗脫（0～1 min，2%B→5%B；1～10 min，5%B→46%B；10～20 min，46%B→80%B；20～35 min，80%B→100%B）；柱溫為35 ℃，進樣量為5 μL，流速為0.3 mL/min。（2）質譜方法：采用電噴霧電離源，在full ms/dd ms2模式下進行數據采集。具體采集參數設置噴霧電壓為3.5 V（+）/2.8 V（－），毛細管溫度為400 °C（+）/350 °C（－），鞘氣（N2）流速為40 psi（+）/35 psi（－），輔助氣體（N2）流速為5 psi，S-lens RF水平為50.0，一級質譜掃描范圍為m/z 100～1 100，二級質譜掃描范圍為m/z 50～750。

2.6.3 分析方法穩定性與精密度考察 在樣本分析過程中插入QC樣本溶液進行分析，以QC樣本溶液中在正、負離子模式下6個隨機化合物保留時間和峰面積的RSD為指標評價分析方法的穩定性與精密度。

2.6.4 數據處理 液質聯用儀采集的原始數據文件通過Discoverer Compound（CD）TM2.0軟件進行峰識別、峰篩選、峰提出以及峰面積的自動計算，最終形成兼具化合物名稱、保留時間、分子量、分子式、峰面積、mzCloud等信息的多維峰表。將上述峰表導入SIMCA-P 14.1軟件進行正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），以變量投影重要性（variable importance in the project，VIP）值＞1且P＜0.05為標準，篩選各組間差異代謝物。同時借助PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、人類代謝組數據庫（HMDB）（http：//www.hmdb.ca/）以及化學標準品對上述差異代謝物進行結構鑒定。最終采用Metabo-Analyst（http：//www.metaboanalyst.ca/）進行生物代謝通路分析。基于通路富集分析和通路拓撲分析，以－lg（P）值＞2和通路影響閾值＞0.05為標準，確定藍刺頭主要影響的代謝通路。

2.7 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件對組間的差異進行統計學分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 各組大鼠血清中骨代謝及氧化應激指標含量的比較

與空白組相比，模型組大鼠血清中HYP、ALP、MDA含量均顯著升高（P＜0.05），TAOC與SOD含量均顯著降低（P＜0.05）。相較于模型組，給予高、中、低劑量的藍刺頭凍干粉藥液及骨疏康藥液可顯著降低大鼠血清中HYP、ALP（藍刺頭低劑量組除外）、MDA含量（P＜0.05），顯著升高大鼠血清中TAOC（藍刺頭低劑量組除外）、SOD含量（P＜0.05）。結果見圖1。

圖1 各組大鼠骨代謝及氧化應激血清指標比較（n＝6）

3.2 各組大鼠骨微結構變化比較

與空白組相比，模型組大鼠BS/BV、Tb·Sp水平均顯著升高（P＜0.05），BMD、BVF、Tb·Th、Tb·N水平均顯著降低（P＜0.05）。相較于模型組，給予高、中、低劑量的藍刺頭凍干粉藥液及骨疏康藥液可顯著降低大鼠BS/BV、Tb·Sp水平（P＜0.05），顯著升高BMD、BVF、Tb·Th（骨疏康組除外）、Tb·N水平（P＜0.05）。PET/CT結果顯示，空白組大鼠脛骨內的骨小梁排列緊密、整齊，骨結構完整；模型組大鼠骨小梁間隙大，出現多處無骨連接的空洞。與模型組相比，骨疏康組和藍刺頭低、中、高劑量組大鼠的骨微結構得到明顯改善，骨小梁結構緊湊，無骨連接的空洞得到修復。結果見圖2、圖3。

圖2 各組大鼠骨微結構指標比較（n＝6）

圖3 各組大鼠脛骨micro-CT圖

3.3 代謝組學分析結果

3.3.1 分析方法穩定性考察結果 如圖4A中QC樣本聚類良好，結果顯示，6個化合物保留時間RSD為0.08%～0.77%、峰面積RSD為0.15%～1.12%，均小于2%，提示分析方法穩定性與精密度良好。

3.3.2 血清代謝輪廓分析 本研究采用OPLS-DA對數據進行分析，揭示組間差異及代謝輪廓。考慮藥效與劑量兩方面，由于藍刺頭低劑量有部分藥效指標與模型組沒有統計學差異，而藍刺頭高劑量是臨床等效劑量4倍，劑量過高與臨床研究不完全切合，因此折中選擇藍刺頭中劑量進行比較。由各模式下得分圖（圖4A～C）可知，模型組與空白組可明顯區分，表明兩組間代謝物存在差異；藍刺頭中劑量組空間分布于二者之間，提示藥物具有逆轉D-半乳糖誘導損傷的作用。模型預測圖（圖略）顯示，模型參數R2、Q2值分別不低于0.749、－0.298，且Q2值始終低于R2。此外，Q2回歸線的截距小于0，提示該OPLS-DA模型未過度擬合，對樣本預測能力良好[10]。

圖4 不同組別OPLS-DA得分圖

3.3.3 差異代謝物篩選與鑒定 結合上述OPLS-DA結果，以VIP值＞1且P＜0.05為篩選條件獲得組間差異代謝物。并將差異代謝物峰的色譜信息與數據庫、化學標準品比對，推測并鑒定差異代謝物的結構。最終獲得藍刺頭用藥后，大鼠血清中花生四烯酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、異亮氨酸、尿酸等18種代謝物發生顯著變化，結果見表1。

表1 藍刺頭治療D-半乳糖誘導骨質疏松的差異代謝物

3.3.4 代謝通路分析的結果 MetaboAnalyst通路分析結果顯示，藍刺頭用藥后共干預15條代謝通路，包括花生四烯酸代謝、苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝等。藍刺頭治療骨質疏松癥主要影響的代謝通路具體包括花生四烯酸代謝[－lg（P）＝4.937，P＝0.007 2]、苯丙氨酸代謝[－lg（P）＝3.360，P＝0.034 7]和酪氨酸代謝[－lg（P）＝2.421 8，P＝0.028 7]。結果見圖5。

圖5 藍刺頭提取物干預骨質疏松癥的代謝通路分析

4 討論

老年性骨質疏松癥病因包括氧化應激損傷、維生素D缺乏、激素變化、缺乏運動的生活方式等。本研究選用D-半乳糖作為衰老誘導劑，通過氧化應激損傷誘發骨質疏松癥，是多數老年性骨質疏松癥的造模方法[11]。為明確模型大鼠細胞氧化應激損傷程度與衰老情況，采用MDA、SOD、TAOC為檢測指標。相關研究表明，MDA含量反映了體內脂質過氧化的速度[12]；血清中的SOD和TAOC含量反映機體抗氧化能力[13―14]。本研究實驗結果顯示，模型組血清中MDA含量較空白組顯著升高，TAOC與SOD含量則較空白組顯著降低，提示D-半乳糖誘導確能激活細胞氧化反應。而采用藍刺頭凍干粉藥液干預后，模型大鼠體內氧化應激指標明顯得到改善，說明藍刺頭具有一定抗氧化作用。

為進一步探究D-半乳糖誘導對大鼠骨代謝水平與骨微結構的影響，本研究檢測了大鼠血清中ALP、HYP含量，并借助PET/CT檢測不同組別大鼠骨微結構變化。ALP與HYP是反映骨形成和骨吸收平衡的重要標志物，若兩者含量升高，說明骨吸收大于骨形成，則易誘發骨質疏松[15]。本次研究結果也證實了這一點，模型組大鼠體內ALP與HYP含量均顯著高于空白組，說明模型組大鼠體內骨吸收速率快。此外，PET/CT檢測結果顯示，與空白組相比，模型組大鼠骨微結構出現一定程度惡化，如 Tb·Sp、BS/BV 均顯著升高，BMD、BVF、Tb·Th、Tb·N均顯著降低，進一步證實了骨質疏松癥的形成。而藍刺頭凍干粉藥液的干預則有利于上述不良情況的逆轉，如給藥后血清中ALP（藍刺頭低劑量組除外）、HYP含量和Tb·Sp、BS/BV均顯著降低，BMD、BVF、Tb·Th、Tb·N均顯著升高。這均是藍刺頭可以改善D-半乳糖誘導的骨質疏松癥臨床癥狀的有力證據。

此外，代謝組學研究結果顯示，藍刺頭通過花生四烯酸、苯丙氨酸、二十二碳六烯酸等代謝物，進而調控花生四烯酸代謝、苯丙氨酸代謝等通路，發揮治療D-半乳糖誘導的骨質疏松癥作用。據相關研究報道，花生四烯酸與二十二碳六烯酸可破壞骨轉化平衡，降低BMD；在骨質疏松病理狀態下，花生四烯酸和二十二碳六烯酸水平較高[16]。本次研究結果也具有以上趨勢，給予藍刺頭凍干粉藥液后，以上代謝物水平得以下調，說明藍刺頭可通過降低體內花生四烯酸和二十二碳六烯酸水平，進而抑制骨轉化平衡的破壞進程，維持骨骼組織內部穩態。苯丙氨酸和酪氨酸代謝是骨組織退化的另一個重要代謝途徑[17]。苯丙氨酸可誘導氧化應激，且參與老年退行性疾病的病理進展過程[18]。本研究中D-半乳糖正是誘導機體氧化應激反應的原因，模型組大鼠體內苯丙氨酸和酪氨酸含量較空白組顯著升高，提示D-半乳糖誘導的骨質疏松大鼠存在苯丙氨酸代謝紊亂。藍刺頭能夠有效降低大鼠體內苯丙氨酸和酪氨酸水平，進而改善D-半乳糖誘導的苯丙氨酸和酪氨酸代謝紊亂。其他氨基酸，如色氨酸、異亮氨酸等，是蛋白質的基本組成部分，也是生命活動的重要物質。以往研究表明，機體長期缺乏色氨酸會導致血清素合成減少，進而導致BMD降低[19]。因此，本研究中色氨酸、異亮氨酸等的變化同樣預示著D-半乳糖誘導后的骨代謝異常。藍刺頭則可通過改善色氨酸、異亮氨酸等代謝紊亂，從而抑制骨質疏松癥的發展。

綜上所述，藍刺頭提取物能夠有效改善D-半乳糖誘導的氧化應激反應及骨微結構惡化，并通過干預花生四烯酸代謝、氨基酸代謝等途徑起效。