“調(diào)理脾胃針刺法”對2型糖尿病腎病大鼠足細胞中PCX、CD2AP、nephrin、desmin表達的影響

劉 亮，董重陽，郝 華，胡錦華，沈少華，譚亞芹，劉白雪，王雄耀

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學中醫(yī)學院針灸教研室，呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學中醫(yī)學院中醫(yī)基礎理論教研室，呼和浩特 010010；3.天津市和平區(qū)新興街社區(qū)衛(wèi)生服務中心，天津 300070；4.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院中醫(yī)科，呼和浩特 010010）

經(jīng)過三十余年的研究，課題組成員發(fā)現(xiàn)脾胃升降異常是2型糖尿病腎病的基本病機[1-2]，并創(chuàng)立“調(diào)理脾胃針刺法”，對患者的糖、脂代謝與免疫損傷都有良性調(diào)節(jié)作用[3]。尿蛋白是 糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）患者的典型癥狀之一，與腎小球基底膜改變有關。DN的主要病理變化是腎小球發(fā)生改變，足細胞的完整性是維持腎小球正常功能的基礎，足細胞損傷是導致蛋白尿的最主要原因[4]。足細胞的結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)生改變，結(jié)構(gòu)功能降低，而引起足細胞受損[5]。故本實驗采用以高脂高糖飲食與低劑量腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ） 聯(lián)合誘導2型糖尿病腎病大鼠為實驗對象，通過“調(diào)理脾胃針刺法”，即針刺干預雙側(cè)中脘、陰陵泉、合谷、三陰交、曲池、足三里、地機、百蟲巢、豐隆、太沖，觀察大鼠尿蛋白實驗期的改變，檢測腎組織系膜基質(zhì)的含量，以及足細胞中的PCX、CD2AP、nephrin、desmin的 mRNA表達，進一步探尋“調(diào)理脾胃針刺法”改善2型糖尿病腎病的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 2型糖尿病腎病大鼠模型的制備方法

選取70只健康雄性SD大鼠（中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心供應），動物生產(chǎn)許可證號：SCXK-（軍）2012-0004，體質(zhì)量為150～180 g。動物房室溫維持在（24±1）℃，相對濕度維持在60%左右。動物被安置在鋼絲底籠內(nèi)，每籠5只，實驗動物在實驗期間自由攝取食物和飲水，動物房內(nèi)設置12 h晝夜循環(huán)標準。天津醫(yī)科大學實驗動物中心動物倫理委員會批準了本實驗的研究議定書（倫理批件編號：TMUaMEC2016008）。

采用空腹腹腔注射STZ的方法制備模型[6]。造模前將造模組先禁食12 h，不限制飲水，并根據(jù)體質(zhì)量一次性快速在腹部注射STZ溶液，STZ以0.1 mol檸檬酸鹽緩沖液配制，pH 4.3。配置后需在避光低溫下靜置，30 min內(nèi)使用完，按注射體積10 mL·kg-1、注射劑量30 mg·kg-1、STZ濃度3 g·L-1注射。注射完成72 h后，在尾靜脈取血，使用血糖儀測量血糖，以5 d連續(xù)隨機測血糖＞16.7 mmo·L-1者，為2型糖尿病造模成功，經(jīng)尿蛋白定性檢測結(jié)果非陰性為2型糖尿病腎病大鼠造模成功[7]。

1.2 實驗試劑和儀器

一次性無菌的針灸針（0.30 mm×15 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；All-in-OneTM qPCR Mix（ 美 國 GeneCopoeia公 司，批 號：AOPR-0200）；CD2AP、PCX、nephrin、desmin上、游下游的合成引物[生工生物工程（上海）公司，批 號：8401615170/8401615171；8401615166/8401615167；BN61204-0001/BN61204-0002；8401615168/8401615169]。GAPDH 上、下 游 的合成引物 [生工生物工程（上海）公司，批號：BN61204-0001/BN61204-0004]；尿蛋白定量測試盒（南京建成，批號：C035-2）；ABI 2720型PCR基因擴增儀（美國Applied Biosystems公司）；石蠟切片機（德國SLEE公司）；顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號：CX31-72C02）。

1.3 分組與干預方法

將造模成功的36只大鼠按照血糖值，以及尿蛋白定性結(jié)果構(gòu)成比，采用分層隨機的方法分為針刺組4周（n= 6），模型組4周（n= 6）；針刺組8周（n= 6），模型組8周（n= 6）；針刺組12周（n= 6），模型組12周（n= 6）。空白組大鼠隨機分為空白組4周（n= 6）、空白組8周（n= 6）、空白組12周（n= 6）。將針刺組穿著針刺罩衣后固定，采用“調(diào)理脾胃針刺法”干預，取雙側(cè)曲池、足三里、地機、中脘、陰陵泉、合谷、三陰交、百蟲巢、豐隆、太沖，將T2DN大鼠置于自制大鼠針刺罩衣中處于仰臥位，固定于操作臺，大鼠躁動基本可控，使多只同時行針刺操作具有可行性。而后針具與穴位常規(guī)消毒，選用一次性無菌針灸針（材質(zhì)：不銹鋼，直徑0.3 mm，長度13 mm）進行針刺，留針1～2 mm，每次留針30 min，不做手法，每日1次，每周6次，分別針刺4周、8周、12周。模型組和空白組與針刺組同時抓取，抓取程度相同。

1.4 尿蛋白含量檢測

T2DN大鼠腎功能下降的主要表現(xiàn)是出現(xiàn)蛋白尿。于第4周末、第8周末、第12周末使用代謝籠收集大鼠24 h尿，于每天上午同一時間搜集尿液，并于量筒中計算每日尿量。收集 24 h尿液用以測定尿蛋白含量并測量體積。經(jīng)離心后檢測。

1.5 qPCR法檢測PCX、CD2AP、nephrin和desmin的mRNA表達水平

針刺4、8及12周后，分批處死大鼠。具體方法：用10%水合氯酸溶液腹腔注射將大鼠麻醉，打開腹腔，推離腸管，分離脊柱前脂肪，暴露出腹主動脈，在其遠心端結(jié)扎，頭皮針穿刺后采血，分離血清，立即送檢。取雙腎后去除包膜，之后在4%多聚甲醛固定液中將腎臟浸泡。其余的部分分不同固定液固定，用于免疫組化檢測，部分用液氮快速冷凍后，放置于-80℃ 的冰箱備用。利用熒光定量PCR法檢測糖尿病腎病SD大鼠泡腎臟組織PCX、CD2AP、nephrin和desmin的 mRNA表達水平。

1.6 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。PCX、CD2AP、nephrin和 desmin的 mRNA表 達水平以均數(shù)±標準差（±s）表示。多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 4周、8周及12周后各組24 h UPro水平比較

見表1。

表1 4周、8周及12周后各組24 h UPro水平比較（±s，n = 6） mg·24 h-1

表1 4周、8周及12周后各組24 h UPro水平比較（±s，n = 6） mg·24 h-1

注：與空白組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；△△P＜0.01

組別 24 h UPro 4 周 8 周 12 周空白組 0.36±0.10 0.64±0.17 0.67±0.12模型組 3.65±1.89# 4.65±1.44# 5.23±1.64#針刺組 1.17±1.08△ 1.23±0.27△△ 1.52±0.40△△

2.2 qPCR法檢測PCX、CD2AP、nephrin和desmin的mRNA表達水平

見表2。

表2 各組CD2AP、PCX、nephrin、desmin的mRNA水平比較（±s，n= 6）

表2 各組CD2AP、PCX、nephrin、desmin的mRNA水平比較（±s，n= 6）

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

mRNA 時間/周 空白組 模型組 針刺組CD2AP 4 1.03±0.06 0.27±0.04## 0.60±0.13△△8 1.00±0.06 0.30±0.05## 0.74±0.06△△12 1.03±0.08 0.30±0.05## 0.63±0.06△△PCX 4 1.00±0.08 0.35±0.09## 0.61±0.08△△8 1.00±0.05 0.32±0.03## 0.62±0.06△△12 1.07±0.07 0.33±0.06## 0.69±0.03△△nephrin 4 1.03±0.10 0.45±0.08## 0.65±0.07△△8 1.04±0.07 0.47±0.06## 0.73±0.06△△12 1.06±0.08 0.38±0.03## 0.69±0.08△△desmin 4 1.04±0.08 2.65±0.50## 1.45±0.17△△8 1.00±0.03 2.85±0.17## 1.45±0.06△△12 1.08±0.05 2.83±0.33## 1.44±0.07△△

2.3 HE法檢測各組腎臟形態(tài)學變化

4周、8周及12周后3組腎臟HE染色顯示，在整個實驗過程中，空白組的腎組織未見明顯的病理變化。模型組腎小球增生，部分腎小管管腔變窄，散在炎性細胞浸潤，基底膜輕度增厚，系膜基質(zhì)增生。針刺組上述病理變化均小于模型組。“調(diào)理脾胃針刺法”可通過減輕腎小球基底膜增厚等病理變化，減輕腎損傷。見圖2。

圖2 4周、8周及12周各組腎臟形態(tài)學表現(xiàn)（HE，×400）

3 討論

DN作為一種足細胞病[8]，其發(fā)生的始動環(huán)節(jié)是足細胞損傷，在細胞層面上表現(xiàn)多為與足突相關蛋白的異常表達。其中，Nephrin是裂孔膜蛋白，支撐足細胞結(jié)構(gòu)和功能[9]。頂膜區(qū)足盂（Podocalyxin，PCX）維持足突結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和保障電荷屏障的完整性[10]，CD2AP 蛋白具有抗凋亡的功效[11]。“調(diào)理脾胃針刺法”可通過提高T2DN大鼠腎臟足細胞PCX、CD2AP、nephrin基因表達的水平進而改善足細胞損傷，而結(jié)蛋白desmin作為一種足細胞的損傷標記物，足細胞損傷通過針刺作用降低desmin基因表達的水平得以修復。本研究發(fā)現(xiàn)“調(diào)理脾胃針刺法”可改善2型糖尿病腎病大鼠血脂及腎功能，降低24 h尿蛋白含量。通過提高T2DN大鼠腎臟足細胞PCX、CD2AP、nephrin基因表達的水平，降低desmin基因表達的水平，以改善T2DN大鼠足細胞損傷，腎小球基底膜增厚等病理改變減輕，從而延緩T2DN的進展，其降低尿蛋白含量的作用機制與此相關，持續(xù)的針刺治療，可對該病起到良性維持作用，對T2DN早期臨床防治具有重要意義。