多指標成分測定篩選冰白含漱液提取工藝

高 穎，劉 樂，朱 明，李旭辰，韓文靜，楊 濤，柳成林*

（1.聯勤保障部隊第964醫院，長春 130021；2.長春中醫藥大學藥學院，長春 130117；3.第93313部隊，長春 130062）

隨著人類生活水平不斷提高，飲食結構發生改變的同時忽略了對口腔護理的關注，使得牙齒頻繁出現問題，以及生活壓力過大導致口腔潰瘍等問題，都為人們的生活帶來極大的不便。口腔異味、牙齦出血、牙齒敏感、口腔潰瘍等問題，近些年來已經成為一個較為嚴重的公共衛生問題[1]。

冰白含漱液處方由黃柏、白及、冰片三味中藥組成，主要用于抑制口腔內的細菌、抗過敏、預防口臭、清新口氣等?，F代藥理學研究和臨床研究證實黃柏的水煎液具有免疫調節作用[2]，其中小檗堿對真菌也有較強抑制作用；白及的有效成分具有促進傷口愈合、抗炎、抗菌等作用[3]。本研究對處方中的有效成分進行測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（型號：LC-20AT 日本島津，SPD檢測器）、超聲波清洗器[型號：TP-300天鵬電子新技術（北京）有限公司]。

1.2 試藥

標準品：黃柏堿、B12、DactylorhinA、B14購于成都普思生物科技有限公司（規格：每支20 mg，批號：ps000447、ps012009、ps011099、ps012643）；藥根堿、巴馬汀、鹽酸小檗堿購于中國食品藥品生物制品檢定院（規格：每支20 mg，批號：0733-200005、0732-200005、110713-200911）。

2 方法與結果

2.1 黃柏多指標含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 1）色譜柱：采用C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；2）流動相：乙腈：0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀（50:50）每100 mL加十二烷基硫酸鈉0.4 g，pH = 4（A）和水（B），梯度洗脫（0～12 min，90% ～ 100%A；12～ 16 min，100%A；16～ 29 min，100% ～ 90%A；29～ 50 min，90%A；50 min，90%A），流動相B為100%-A；3）檢測波長：283 nm、254 nm；4）柱溫：室溫；5）流速：1.0 mL·min-1；6）進樣量：10 μL。

2.1.2 溶液的配制

2.1.2.1 對照品儲備液 精密稱取黃柏堿、藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對照品分別為2.66 mg、1.08 mg、8.29 mg、8.25 mg，甲醇制備濃度分別為 0.532 mg·mL-1、0.216 mg·mL-1、1.658 mg·mL-1、1.650 mg·mL-1儲備液。

2.1.2.2 混合對照品溶液 精密吸取黃柏堿、藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對照品儲備液，制成 濃 度 分 別 為 133.0 μg·mL-1、54.0 μg·mL-1、414.5 μg·mL-1、412.5 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.2.3 供試品溶液 按處方量，稱取黃柏15 g，白及15 g，置于煎藥鍋中，煎煮3次，8倍量水，每次2 h，過濾得濾液，合并3次所得濾液，濃縮到適量體積，即得。

2.1.3 黃柏多指標含量測定的方法學考察

2.1.3.1 線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL、12.0 mL、14.0 mL、16.0 mL，液相色譜儀檢測。繪制標準曲線，計算回歸方程，結果見表1。

表1 黃柏四個成分線性關系考察

2.1.3.2 儀器精密度試驗 取同一對照品溶液，精密吸取10 μL，于不同時間、不同儀器、不同人員分別測定，連續進樣6次，記錄圖譜。黃柏堿、藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積的RSD值分別為0.71%、0.69%、0.73%、0.77%。RSD平均值都小于1%。

2.1.3.3 穩定性考察 精密吸取供試品溶液 10 μL，按“2.1.1”條件在 0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h進樣，記錄色譜圖，測得峰面積。結果黃柏堿、藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積的RSD值分別為2.50%，1.41%，0.65%，0.61%。

2.1.3.4 重復性考察 同一批次藥材按 “2.1.2.3”制備供試品溶液，再按“2.1.1”色譜條件測定，記錄色譜圖，測定峰面積。結果黃柏堿、藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積的RSD值分別為1.25%，2.55%，1.50%，1.20%。

2.1.3.5 加樣回收率考察 精密稱取已知含量的樣品 6 份，每份約2.5 g，置20 mL量瓶中，加甲醇和對照品適量按 “2.1.2.3”制備供試品溶液，再按“2.1.1”條件測定。結果黃柏堿、藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的平均回收率分別為97.79%，107.7%，102.88%，104.99%，RSD值分別為1.17%，0.96%，1.41%，1.23%。

2.2 白及多指標含量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件 1）色譜柱：采用C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；2）流動相：乙腈：（A）和0.1%磷酸水（B），梯度洗脫（0～4 min，5%～8%A；4～5 min，8%A；5～6 min，8%～10%A；6～10 min，10%～12%A；10～24 min，12%～30%A；24～ 27 min，30% ～ 31%A；27～ 32 min，31%A；32～33 min，31%～37%A；33～40 min，37%～55%A ），流動相B為100%-A；3）檢測波長：220 nm；4）柱溫：室溫；5）流速：1.0 mL·min-1；6）進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液的配制

2.2.2.1 對照品儲備液 分別精密稱取4-（葡糖糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基芐酯、dactylorhinA、1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯對照品2.58 mg、7.17 mg、10.8 mg，甲醇溶液溶解并稀釋濃度分別為0.516 mg·mL-1、1.434 mg·mL-1、2.160 mg·mL-1的4-（葡糖糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基芐酯、dactylorhinA、1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯對照品儲備液，備用。

2.2.2.2 混合對照品溶液 精密吸取4-（葡糖糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基芐酯、dactylorhinA、1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯對照品儲備液適量，混合均勻，配制成含4-（葡糖糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基芐酯、dactylorhinA、1，4-二［4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯對照品濃度分別為 172 μg·mL-1、478 μg·mL-1、720 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2.3 供試品溶液 同“2.1.2.3項下”供試品溶液制備方法。

2.2.3 白及多指標含量測定的方法學考察

2.2.3.1 線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL、12.0 mL、14.0 mL、16.0 mL，液相色譜儀檢測。繪制標準曲線，計算回歸方程，結果見表2。

表2 白及三個成分線性關系考察

2.2.3.2 儀器精密度試驗 取同一對照品溶液，精密吸取10 μL，于不同時間、不同儀器、不同人員分別測定，連續進樣6次，記錄圖譜。4-（葡糖糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基芐酯、dactylorhinA、1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯峰面積的RSD值分別為0.34%、0.42%、0.40%。RSD平均值都＜1%。

2.2.3.3 穩定性考察 供試品溶液按“2.1.1”項下色譜條件分別在 0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h進樣。結果4-（葡糖糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基芐酯、dactylorhinA、1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯峰面積的RSD值分別為0.70%，1.26%，0.68%。

2.2.3.4 重復性考察 同一批次藥材按 “2.1.2.3”方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”條件測定。結果4-（葡糖糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基芐酯、dactylorhinA、1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯峰面積的RSD值分別為2.43%、1.60%、0.80%。表明該方法重復性良好。

2.2.3.5 加樣回收率考察 精密稱取已知含量的樣品 6 份，每份約2.5 g，置20 mL量瓶中，加甲醇和對照品適量按“2.1.2.3”方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”條件測定。結果4-（葡糖糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基芐酯、dactylorhinA、1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯的平均回收率分別為105.03%、108.22%、107.05%，RSD值分別為1.24%、1.48%、1.45%。

2.3 冰白含漱液提取工藝優化的正交試驗考察

2.3.1 綜合評價冰白含漱液提取工藝

2.3.1.1 轉移率的測定 以黃柏堿、藥根堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、4-（葡糖糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基芐酯、dactylorhinA等7個有效成分的平均轉移率考察冰白含漱液提取工藝。

2.3.1.2 出膏率的測定 精密吸取“2.1.2.3”項下供試品溶液，蒸發干燥至恒重。出膏率為浸膏質量與藥材質量比值的百分數。

2.3.1.3 綜合評價計算方法 均轉移率權重系數70%，出膏率權重系數30%，綜合評價冰白含漱液提取工藝。

2.3.2 基于綜合評價的正交試驗考察 提取次數（A）、溶劑用量（B）、提取時間（C）3種因素，每種因素 3 個水平，結果見表3、表4。

表3 提取的因素水平

表4 正交實驗直觀分析結果

根據方差結果可以判斷，各因素對冰白含漱液中七種成分提取影響大小的順序為A＞C＞B＞D，最佳提取工藝為A3B2C3D2。根據表5結果可以判斷，A因素對各有效成分提取率呈顯著性影響（P＜0.05），B、D因素在考察范圍內影響較小，無顯著性影響，C因素對各有效成分提取率有顯著統計學差異（P＜0.01），考慮到大生產的成本問題，優選工藝為A3B1C3D1，即加6倍量提取3次，每次2 h，為冰白含漱液提取最佳工藝。

表5 方差分析結果

3 討論

冰白含漱液由黃柏、白及、冰片三味中藥組成。黃柏性苦寒，具有清熱、消腫、止疼等功效[4]。黃柏有效成分具有抗炎殺菌等藥理作用[5]，黃柏堿也具有抑制細胞免疫的作用[6]。白及作為傳統中藥，已經有2000多年的歷史，其藥理活性主要包括抗菌消炎、抗潰瘍等方面[7]。近千年來，冰片在中藥方劑中常作為佐使藥使用。黃柏、白及、冰片三藥配伍使得藥物發揮更好的療效[8]。

中藥藥方的功效是其所含成分綜合作用得到的結果[9]。本研究選取冰白含漱液中的七種有效成分作為考察指標，建立了簡單、高效、準確的含量測定方法[10]。提取工藝是制備過程中的重要環節，提取工藝決定著中藥制劑的質量[11]。本研究以綜合分數作為考察指標，通過正交實驗設計考察提取次數、溶劑用量、提取時間對冰白含漱液中各指標提取工藝的影響，進一步確定了最佳的提取工藝為6倍量水，提取3次，每次2 h。研究結果為冰白含漱液的臨床應用奠定了基礎。