SKAP1通過調(diào)控ICAM-1對宮頸癌模型小鼠腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究

鄭再宏，閆錫釗，李 博，丁珍珍

（滄州市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 滄州 061000）

宮頸癌是常見的女性惡性腫瘤疾病，具有較高的發(fā)病率和病死率，患者五年存活率僅為20%～30%[1]。腫瘤細(xì)胞的遷移是人類癌變過程中的關(guān)鍵步驟，因?yàn)樗鼧?gòu)成了轉(zhuǎn)移的病理生理基礎(chǔ)，該過程包括惡性細(xì)胞與血管內(nèi)皮粘連，以便侵入周圍組織，其中黏附分子在這一過程中起主要作用[2]。細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion moleclar-1，ICAM-1）是屬于β2-整合素家族，有研究顯示其在宮頸癌腫瘤細(xì)胞中的過度表達(dá)與通過粘附內(nèi)皮細(xì)胞的血管侵入有一定相關(guān)性，這意味著該分子在轉(zhuǎn)移灶的產(chǎn)生中可能發(fā)揮作用[3]。SKAP1是一種免疫細(xì)胞接頭蛋白，能通過安排和組裝多分子信號復(fù)合體來協(xié)調(diào)淋巴細(xì)胞的激活和分化，且SKAP1二聚體形成可穩(wěn)定SLP-76微簇并促進(jìn)粘附[4-5]。所以ICAM-1和SKAP1的表達(dá)在可能免疫調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮重要作用，但是其在宮頸癌中的調(diào)控機(jī)制至今還未見報道。本研究旨在探索宮頸癌中SKAP1與ICAM-1介導(dǎo)的免疫調(diào)控機(jī)制，為開發(fā)針對該靶點(diǎn)的免疫抑制劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞

人宮頸癌細(xì)胞株HeLa，購自北京大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室。雌性BLAB/c裸鼠30只，5～6周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自上海市計劃生育科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動物經(jīng)營部，動物生產(chǎn)許可：SCXK（滬）2018-0006，在滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校動物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，動物使用許可證號SYXK（冀）2019-006。恒溫18～22℃，濕度50%～80%，密閉無菌環(huán)境。本研究參照中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物物研究所實(shí)驗(yàn)動物使用與管理委員會執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器

干擾質(zhì)粒，購自美國Invitrogen公司；DMEM高糖培養(yǎng)基，購自美國Gibco公司；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，購自北京索萊寶公司；胎牛血清，購自杭州四季青公司；TrizolTM RNA Isolation Reagent購自美國GIBCO公司；M-MLV reverse transcriptase，購自上海澤葉生物科技有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒，購自美國Genomed公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒、免疫組化試劑盒均購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；DAB顯色試劑盒，購自北京中山生物技術(shù)有限公司；鼠抗人SKAP1單克隆抗體、鼠抗人ICAM-1單克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體及辣根過氧化酶標(biāo)記二抗均購自美國Abcam公司；Western blot化學(xué)發(fā)光工作液，購自意大利Cyanagen公司。

OLYMPUS-IX70倒置相差熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；Image Station In-Vivo FX多功能活體成像系統(tǒng)（美國KODAK公司）；Light Cycler Nano實(shí)時熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司）；全波長掃描酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Image Quant LAS4000mini成像儀（美國GE公司）；BIO-RAD Mini Trans-Blot垂直電泳/電轉(zhuǎn)系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）；BD Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及感染

宮頸癌HeLa細(xì)胞貼壁生長于DMEM培養(yǎng)基（含有10 %胎牛血清、青霉素10×104U·L-1、鏈霉素100 mg·L-1），于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育，2～3 d換液1次。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%融合度時用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化并計數(shù)，以5×105/孔接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h，以利于轉(zhuǎn)染。將干擾SKAP1的stealth RNA轉(zhuǎn)變成miRNA并構(gòu)建到pcDNA6.2TM-GW/EmGFP-miR載體中，形成針對SKAP1的miRNA的干擾載體-SKAP1-miRNA，同時設(shè)計合成陰性對照質(zhì)粒（Neg-miRNA），以上均由江蘇齊氏生物科技有限公司設(shè)計并合成。按照慢病毒說明書進(jìn)行細(xì)胞感染，通過Lipofectamine 2000介導(dǎo)，將SKAP1-miRNA、Neg-miRNA每孔2 μg轉(zhuǎn)入HeLa細(xì)胞中，同時，以僅加脂質(zhì)體及未加任何干擾措施的細(xì)胞作為對照，轉(zhuǎn)染4～5 h后更換DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后將細(xì)胞消化，制成單細(xì)胞懸液，以每孔1個細(xì)胞的量接種于96孔板，加入1 μg·mL-1的嘌呤霉素，得到具有嘌呤霉素抗性的單克隆細(xì)胞，即為穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞。在慢病毒感染細(xì)胞72 h后，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的感染效率和細(xì)胞狀態(tài)，選取感染效率80%左右且狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 宮頸癌模型小鼠的構(gòu)建及分組

將BALB/c裸鼠隨機(jī)分為對照組（細(xì)胞未做處理）、空質(zhì)粒組（Neg-miRNA組）和SKAP1基因沉默組（SKAP1-miRNA組），每組10只。取穩(wěn)定表達(dá)的各組HeLa細(xì)胞，用PBS重懸，配制成每毫升1×107的細(xì)胞懸液，分裝至無菌EP管中，每管0.2 mL。用微量進(jìn)樣器抽取0.2 mL混勻的HeLa細(xì)胞懸液接種于右前腋窩中部外側(cè)皮下，接種時盡量保證與接種點(diǎn)的距離不超過針頭長度，并避免刺破皮膚或者刺破肌肉層，當(dāng)針頭到達(dá)接種位點(diǎn)時注射，退出針頭，壓迫進(jìn)針處，避免漏液。

1.5 評價指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 觀察各組腫瘤生長情況 接種后繼續(xù)飼養(yǎng)30 d，期間每隔3 d用直尺測量1次瘤體的長軸（a）、短軸（b），根據(jù)體積近似公式V=（a×b）2÷2（mm3）計算腫瘤體積。

1.5.2 活體熒光成像技術(shù)檢測裸鼠腫瘤轉(zhuǎn)移情況 在接種第30 d后采用活體熒光成像技術(shù)檢測小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移情況。觀察前1 d每只裸鼠腹腔注射熒光素底物（1.5 mg·10 g-1），飽和三溴乙醇（0.18 mL·10 g-1）麻醉后放入活體熒光影像系統(tǒng)攝像，應(yīng)用Slide Book 4.0軟件進(jìn)行分析。

1.5.3 Real-Time PCR法檢測腫瘤組織SKAP1、ICAM-1 mRNA相對表達(dá)量 斷頸脫臼處死小鼠，迅速取出腫瘤組織分成兩部分。一部分迅速置入液氮中保存，另一部分放入福爾馬林中固定。取液氮冷凍的腫瘤組織，碾磨。按照TrizolTMRNA Isolation Reagent說明書提取總RNA，然后用M-MLV reverse transcriptase將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系：cDNA模板5 μL，上下游引物各0.8 μL，SYBR Premix Ex Taq TM 10 μL，ROX Reference Dye II 0.4 μL，dd H2O 3 μL。使用 RT-PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR循環(huán)條件：95℃預(yù)變性10 S，95℃變性15 S，60℃退火30 S，60℃延伸60 S，共40個循環(huán)。相對表達(dá)水平以GAPDH為內(nèi)參。記錄各孔Ct值（擴(kuò)增動力曲線拐點(diǎn)），目的基因的相對表達(dá)水平=2-ΔΔCt。PCR引物序列由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成（引物序列見表1）。

表1 引物序列

1.5.4 免疫組化法檢測腫瘤組織SKAP1、ICAM-1蛋白表達(dá)情況 腫瘤組織經(jīng)福爾馬林溶液固定48 h后，按照常規(guī)操作步驟依次進(jìn)行石蠟包埋、脫蠟水化、內(nèi)源性過氧化物酶滅火、抗原修復(fù)、滴加一抗、二抗，DAB顯色，然后復(fù)染、封片，于顯微鏡下觀察。

1.5.5 Western blot法檢測腫瘤組織SKAP1、ICAM蛋白相對表達(dá)量 取凍存的裸鼠腫瘤組織，PBS沖洗3次，加入蛋白裂解液，勻漿后在4℃條件下2 500 r·min-1離心10 min，棄上清液，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。加入上樣緩沖液，煮沸5 min，-80℃保存。SDS-PACE電泳分離目的蛋白，恒定電流轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶于室溫封閉2 h，加入用TBS稀釋的SKAP1、ICAM-1、GAPDH一抗，4℃孵育過夜，TBS洗滌液洗膜后加入用TBS按1: 5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育90 min，TBS洗滌液漂洗3次，堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光顯色并拍照，凝膠成像系統(tǒng)分析灰度值。目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值比值為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.5.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤組織免疫細(xì)胞CD3+、CD4+、CD8+水平 取凍存的裸鼠腫瘤組織研磨，收集組織懸液，離心棄上清，加入3倍體積紅細(xì)胞裂解液，冰上裂解5 min，離心棄上清，RPMI-1640重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升l×107個。加入流式管，每管100 μL，加入熒光標(biāo)記的CD3、CD4、CD8單抗，混勻，室溫避光孵育20 min，加入2 mL PBS緩沖液，離心棄上清，加入0.5 mL PBS緩沖液重懸，流式細(xì)胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+水平。

1.5.7 ELISA法檢測腫瘤組織Th1和Th2細(xì)胞因子水平 取凍存的裸鼠腫瘤組織研磨，收集組織懸液，離心收集上清，按照小鼠白細(xì)胞介素-2（interleukin，IL-2）、干擾素（interferon-gamma，IFN-γ）、IL-4和IL-10 ELISA試劑盒操作步驟，測定OD 450 nm值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及OD值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各組腫瘤組織中IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腫瘤生長情況比較

細(xì)胞接種后飼養(yǎng)期間，對照組和空質(zhì)粒組裸鼠各死亡1只，SKAP1基因沉默組死亡2只。各組瘤體體積均隨時間延長而增大（P＜0.05）。見表2。

表2 各組腫瘤體積變化比較（±s ） mm3

表2 各組腫瘤體積變化比較（±s ） mm3

注：與對照組比較，# P＜0.05；與空質(zhì)粒組比較，△P＜0.05

時間/d 對照組（n = 9） 空質(zhì)粒組（n = 9） SKAP1基因沉默組（n = 8）3 138.42±14.52 140.76±15.25 92.47±10.26#△6 322.28±23.41 326.69±33.24 211.17±26.88#△9 523.35±64.74 531.97±55.68 359.76±44.16#△12 726.68±75.56 731.57±75.29 586.23±61.22#△15 1 058.73±100.25 998.67±106.47 602.74±62.69#△18 1 368.85±120.58 1 357.54±140.71 1 058.69±105.47#△21 1 757.45±171.24 1 804.63±208.87 1 308.89±136.64#△24 2 145.63±219.36 2 085.46±223.37 1 668.42±172.25#△27 2 541.69±236.42 2 489.39±251.42 2 045.58±212.39#△30 2 758.89±300.25 2 699.75±286.64 2 314.11±236.57#△

2.2 各組腫瘤轉(zhuǎn)移情況比較

活體熒光成像檢測各組裸鼠腫瘤組織轉(zhuǎn)移情況結(jié)果顯示，對照組和空質(zhì)粒組的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移面積較大，且熒光信號較強(qiáng)，而SKAP1基因沉默組腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移面積較小，熒光信號強(qiáng)度較弱。見表3、圖1。

圖1 活體熒光成像檢測腫瘤組織的轉(zhuǎn)移

表3 各組平均熒光信號強(qiáng)度比較（±s ） a.u.

表3 各組平均熒光信號強(qiáng)度比較（±s ） a.u.

注：與對照組比較，# P＜0.05；與空質(zhì)粒組比較，△P＜0.05

組別 例數(shù) 平均熒光強(qiáng)度對照組 9 301.15±69.65空質(zhì)粒組 9 296.64±32.27 SKAP1基因沉默組 8 105.49±11.23#△

2.3 各組腫瘤組織SKAP1、ICAM-1 mRNA相對表達(dá)量比較

見表4。

表4 各組腫瘤組織SKAP1、ICAM-1 mRNA相對表達(dá)量比較（±s ）

表4 各組腫瘤組織SKAP1、ICAM-1 mRNA相對表達(dá)量比較（±s ）

注：與對照組比較，# P＜0.05；與空質(zhì)粒組比較，△P＜0.05

組別 例數(shù) SKAP1 mRNA ICAM-1 mRNA對照組 9 1.15±0.12 0.98±0.10空質(zhì)粒組 9 1.03±0.11 0.92±0.09 SKAP1基因沉默組 8 0.45±0.05#△ 0.43±0.04#△

2.4 各組腫瘤組織SKAP1、ICAM-1蛋白表達(dá)情況比較

免疫組化結(jié)果顯示，SKAP1基因沉默組腫瘤組織SKAP1、ICAM-1蛋白陽性表達(dá)量較高，而對照組和空質(zhì)粒組蛋白陽性表達(dá)量較低。見圖2。

圖2 免疫組化檢測腫瘤組織中SKAP1、ICAM-1蛋白表達(dá)

注：A為免疫組化檢測SKAP1蛋白；B為免疫組化檢測ICAM-1蛋白（×200）；a為對照組；b為空質(zhì)粒組；c為SKAP1基因沉默組

2.5 各組腫瘤組織SKAP1、ICAM蛋白相對表達(dá)量比較

見圖3、表5。

表5 各組腫瘤組織SKAP1、ICAM-1相對表達(dá)量比較（±s ）

表5 各組腫瘤組織SKAP1、ICAM-1相對表達(dá)量比較（±s ）

注：與對照組比較，# P＜0.05；與空質(zhì)粒組比較，△P＜0.05

組別 例數(shù) SKAP1 ICAM-1對照組 9 0.99±0.11 0.88±0.09空質(zhì)粒組 9 0.94±0.10 0.85±0.09 SKAP1基因沉默組 8 0.39±0.04#△ 0.35±0.04#△

圖3 Western blot條帶圖

2.6 各組腫瘤組織免疫細(xì)胞CD3+、CD4+、CD8+水平比較

見表6。

表6 各組腫瘤組織免疫細(xì)胞CD3+、CD4+、CD8+水平比較（±s ）

表6 各組腫瘤組織免疫細(xì)胞CD3+、CD4+、CD8+水平比較（±s ）

注：與對照組比較，# P＜0.05；與空質(zhì)粒組比較，△P＜0.05

組別 例數(shù) CD3+/% CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+對照組 9 28.85±2.96 15.53±1.62 15.85±2.03 0.98±0.12空質(zhì)粒組 9 29.14±3.02 15.98±1.56 16.04±1.84 1.00±0.11 SKAP1基因沉默組 8 36.63±4.01#△ 19.96±2.21#△ 11.17±1.29#△ 1.79±0.18#△

2.7 各組腫瘤組織Th1和Th2細(xì)胞因子水平比較

見表7。

表7 各組腫瘤組織Th1和Th2細(xì)胞因子水平比較（±s ） ng·L-1

表7 各組腫瘤組織Th1和Th2細(xì)胞因子水平比較（±s ） ng·L-1

注：與對照組比較，# P＜0.05；與空質(zhì)粒組比較，△P＜0.05

組別 例數(shù) IL-2 IFN-γ IL-4 IL-10對照組 9 198.52±20.36 401.15±41.56 130.25±14.53 352.29±36.63空質(zhì)粒組 9 201.18±21.24 399.85±40.57 129.84±13.81 349.84±35.49 SKAP1基因沉默組 8 314.42±32.65#△ 598.85±62.18#△ 75.54±7.86#△ 202.52±21.14#△

3 討論

SKAP1在多種實(shí)體瘤中高表達(dá)，其表達(dá)越高，患者生存率越低[6]。在前期研究中，宮頸癌患者腫瘤組織中SKAP1呈現(xiàn)高表達(dá)，且與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征及患者預(yù)后有一定關(guān)系。在本次研究中，沉默SKAP1基因后，裸鼠瘤體體積增加幅度以及腫瘤轉(zhuǎn)移程度均小于對照組和空質(zhì)粒組，而對照組和空質(zhì)粒組并無明顯差異，這說明抑制SKAP1表達(dá)可在一定程度上抑制腫瘤生長及其轉(zhuǎn)移。SKAP1基因位于人類的第十七對常染色體，主要以蛋白的形式存在于T細(xì)胞中，作為免疫細(xì)胞特有的接頭蛋白，其具有SH2或SH3接頭蛋白活性，主要功能為結(jié)合含SH2或SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白，能與蛋白、蛋白復(fù)合物、蛋白激酶和蛋白磷酸酶結(jié)合[7]。本研究結(jié)果顯示，SKAP1基因沉默組腫瘤組織免疫細(xì)胞CD3+、CD4+、CD4+/CD8+及 Th1細(xì) 胞 因 子 IL-2、IFN-γ水平均高于對照組和空質(zhì)粒組，CD8+和Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-10水平均低于對照組和空質(zhì)粒組，說明沉默SKAP1基因可在一定程度上逆轉(zhuǎn)Th1/Th2漂移，恢復(fù)Th1細(xì)胞因子優(yōu)勢，改善裸鼠免疫功能。SKAP1的表達(dá)在免疫調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮重要作用，可能是自身免疫性和難治性疾病治療干預(yù)的一個有吸引力的靶點(diǎn)。

SKAP1是TCR誘導(dǎo)的RapL-Rap1復(fù)合物形成和ICAM1活化所需的上游調(diào)節(jié)因子[8]。SKAP1是RapL以一種依賴于SKAP1的PH結(jié)構(gòu)域和PI3K通路的方式與膜結(jié)合所必需的，SKAP1 PH結(jié)構(gòu)域失活突變（即R131M）顯著損害RapL向Rap1和ICAM1結(jié)合膜的轉(zhuǎn)位以及ICAM1結(jié)合的上調(diào)[9]。對于SKAP1能夠介導(dǎo)免疫浸潤T細(xì)胞，而ICAM-1在調(diào)控腫瘤免疫細(xì)胞中不可或缺的作用。本研究結(jié)果顯示，SKAP1基因沉默組腫瘤組織SKAP1、ICAM-1 mRNA及其蛋白相對表達(dá)量均低于對照組和空質(zhì)粒組，而對照組與空質(zhì)粒組腫瘤組織并無明顯差異，提示沉默SKAP1基因可能在一定程度上下調(diào)ICAM-1表達(dá)。原因可能是T細(xì)胞受到刺激后，TCR/CD3轉(zhuǎn)導(dǎo)的早期第一信號引起淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1對ICAM-1的親和力及親合力瞬時上調(diào)，SKAP1進(jìn)一步促進(jìn)淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1和ICAM-1在T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞接觸區(qū)域的相互作用，進(jìn)而影響T細(xì)胞的活化[10]。