間歇有氧運動對大鼠心肌NOX4、ROS表達及血清相關氧化因子的影響

張偉超，邢維新

(麗江師范高等專科學校體育與健康學院，云南麗江 674199)

0 引言

氧化應激是指機體接觸各種有害刺激時，體內活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量生成，造成機體損傷[1].NADPH氧化酶(NADPH oxidases，Noxs)是心血管系統中ROS的主要來源，NOX4是NADPH氧化酶的同源型之一，缺血心肌NOX4表達顯著增加，ROS產生增強，發揮心臟保護作用[2].乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)是糖酵解通路中的主要酶，可催化乳酸變成丙酮酸，參與主要器官的氧化反應，引起機體的氧化應激水平增加[3].丙二醛(Malonic dialdehyde, MDA)是細胞和組織過氧化最重要的產物之一，可反映組織過氧化損傷程度[4].超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)是脂質過氧化誘導的自由基，是常測量的氧化應激生物標志物之一[5].

近年來，有關運動訓練與氧化應激相關研究已成為體育科學研究領域的一個重大熱點課題，引起了國內外相關學者的高度關注.Ranjbar研究表明，中等強度有氧運動可降低心肌損傷，抑制氧化應激，增加抗氧化防御系統，提升心功能[6].運動訓練對心肌ROS和NOX4表達及血清相關氧化因子的影響已有文獻報道.Bostick等研究表明，運動可降低雌性肥胖小鼠血清LDH、MDA表達，增強SOD活性[7].米春娟研究證實，16周中等強度有氧運動可以降低心臟ROS表達[8].侯改霞研究發現，游泳可以降低2型糖尿病大鼠心臟NOX4表達[9].可見，目前國內外對心肌氧化應激相關研究主要集中在心血管疾病、糖尿病等動物模型中，且缺乏全面系統的文獻報道.本文運用DHE活性氧熒光探針、生物化學法以及Western Blot等方法，全面系統地探討間歇有氧運動對正常大鼠心肌NOX4、ROS表達以及血清相關氧化因子的影響，為運動提升心功能的機制提供實驗依據，同時為運動提升心功能運動處方的研制提供實驗參考.

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Leica CM1950冰凍切片機、Epoch微量紫外分光光度計、ALC-V8動物呼吸機、PowerLab/8ST生物信號采集處理系統、LEICA-RM2126切片機、BMⅡ型病理組織包埋機、生物組織攤烤片機、ASB240U生物信號采集分析系統、BX51奧林巴斯光學顯微鏡、Nikon Eclipse55i熒光顯微鏡、低溫高速離心機、酶標儀、Bio-rad電泳儀和轉移槽、凝膠成像系統、小動物跑臺等.

1.2 主要試劑

BCA蛋白定量試劑盒、MDA試劑盒、SOD試劑盒、LDH試劑盒(南京建成生物有限公司)、DHE活性氧熒光探針試劑盒(碧云天生物有限公司)、兔抗單克隆抗體NOX4(美國Abcam公司).

1.3 動物分組和運動方案

1.3.1 動物分組 雄性3月齡清潔級SD大鼠20只(西安交通大學實驗動物管理中心)，體重180～220 g，健康狀況良好，國家嚙齒類動物標準喂養，相對濕度40%～50%，動物室內溫度25～29 ℃，分每籠10只飼養，適應性喂養一周后，隨機分為C組和CE組.

1.3.2 運動方案 運動方案參考Wisloff訓練模型略加改動[10].(1)CE組大鼠適應性喂養3天后進行跑臺運動.第一周為適應性訓練(15 m/min，30 min/d，共5 d).正式訓練時，起始訓練速度10 m/min，時間為10 min.之后進行間歇有氧運動，速度為25 m/min，運動7 min；后間歇3min，速度為15 m/min，依次交替進行，每次運動總時間為60 min.每周周一至周五訓練，連續訓練4周；(2)血流動力學 4周間歇有氧運動訓練結束后，次日上午9:00，采用多導生理記錄儀測試左室收縮壓(Left ventricular pressure, LVSP)、左室舒張末壓(Left ventricular systolic pressure, LVEDP)左室壓力最大上升速率(+dp/dtmax)和最大下降速率(-dp/dtmax)等心功能指標；(3)取材、樣品制備.血流動力學檢測后，迅速開胸摘取心臟，置于10%中性甲醛溶液固定、常規酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(厚度為5 μm)，用于HE染色.選取大鼠心臟，多聚甲醛固定，30%蔗糖溶液脫水后，OCT包埋用于冰凍切片.另取大鼠心臟置于-196 ℃液氮速凍后，-80 ℃冰箱保存待用，用于Western Blot實驗；(4)Dihydroethidium(DHE)染色檢測ROS.取10%中性甲醛固定心肌組織，放于蔗糖溶液中，OCT包埋，冰凍切片，滴加DHE工作液，37 ℃避光，孵育30 min，封片，用熒光顯微鏡觀察結果，檢測心臟超氧陰離子水平；(5)生物化學法.采用紫外分光光度法測定心臟丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性，微量酶標法測定乳酸脫氫酶(LDH)活力，嚴格按照試劑盒說明書操作程序進行；(6)Western Blot 實驗.取心肌組織50 mg，加入預冷蛋白抽提試劑500 ul，剪碎勻漿，4 ℃離心，取上清液，BCA蛋白定量.常規制膠、上樣、電泳、轉膜，5%BSA室溫封閉1 h，孵育一抗NOX4(稀釋濃度1:2 000)，內參GAPDH稀釋濃度(1:10 000)，4 ℃過夜.次日室溫復溫30 min后，室溫孵育二抗(1:8 000)1 h，TBST清洗，ECL發光，凝膠成像系統分析；(7)圖像處理與數據分析.光學顯微鏡拍攝圖像，經Image-Pro Plus軟件處理并分析.所有數據均采用SPSS17.0軟件包進行處理，采用One-Way ANOVA進行統計學分析，實驗結果均以平均數±標準差(X±SD)表示，組間顯著性差異水平為P<0.05和P<0.01，Graph Pad prism5.0軟件將有效數據進行轉換之后作圖.

2 實驗結果

2.1 HE染色結果

圖1結果顯示，與C組比較，CE組大鼠心肌細胞排列緊密，結構整齊.表明間歇運動可以顯著改善大鼠心臟形態結構(見圖1).

圖1 大鼠HE染色觀察結果(5 μm，x200)Fig.1 HE staining of rats (5μm, x200)

2.2 心功能測定結果

表1結果顯示，與C組比較，CE組大鼠LVEDP顯著降低(P<0.01)，LVSP和±dp/dtmax顯著升高(P<0.01)，表明間歇運動可以顯著改善大鼠心功能.

表1 大鼠血流動力學指標變化(n=10)Tab.1 Changes of hemodynamic indexes in rats (n=10)

2.3 生物化學法結果

表2結果顯示，與C組比較，CE組MDA和LDH表達均顯著降低(分別為P<0.01，P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.01).表明間歇運動可降低大鼠心臟氧化應激，顯著改善大鼠心功能.

表2 大鼠氧化應激指標變化Tab.2 Changes of oxidative stress indexes in rats

2.4 DHE染色結果

DHE染色結果顯示，與C組比較，CE組心肌組織中ROS水平降低，表明，間歇運動可降低心肌組織氧化應激水平(非彩圖，出不了效果，圖略).

2.5 大鼠心臟NOX4蛋白表達結果

Western Blot結果顯示，與C組比較，CE組大鼠心臟NOX4蛋白表達顯著降低(P<0.05).表明間歇運動可抑制大鼠心臟NOX4蛋白表達，降低氧化應激水平(見圖2).

圖2 大鼠心臟NOX4蛋白表達Fig.2 NOX4 protein expression in rat heart

3 分析與討論

3.1 間歇有氧運動可對大鼠心臟形態結構與功能產生影響

目前研究認為，運動可顯著改善大鼠心肌的形態結構，提升心功能[11-14].本文運用HE染色觀察大鼠心臟形態結構，血流動力學測定心臟功能，結果顯示，與C組比較，CE組大鼠心臟細胞排列緊密，結構整齊，LVEDP顯著降低，LVSP和±dp/dtmax顯著升高.綜上，本文再次全面系統證實了間歇有氧運動可顯著改善大鼠心臟結構，提升心功能.

3.2 間歇有氧運動對大鼠血清MDA、LDH、SOD的影響

氧化應激是指機體接觸各種有害刺激時，體內氧化與抗氧化作用失衡，活性氧大量生成，導致中性粒細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產生大量氧化中間產物，造成機體損傷[15].LDH是一種糖酵解酶，廣泛分布于肝臟、心臟、骨骼肌腎臟等組織細胞，可催化丙酮酸接受由3-磷酸甘油醛脫氫酶形成的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的氫，形成乳酸，發生氧化反應.研究表明，LDH可催化乳酸變成丙酮酸參與主要器官的氧化反應，引起機體的氧化應激水平增加，機體功能下降[16].Wenjuan Wei研究證實，在心肌缺血再灌注損傷模型中，LDH表達顯著增加，氧化應激水平升高，進而造成心肌損傷，心功能下降[17].MDA是脂質過氧化誘導的自由基，是常測量的氧化應激生物標志物之一，其含量是反映機體抗氧化潛在能力的重要參數，亦可反映組織過氧化損傷程度[4].劉派研究證實，MDA升高，氧化應激增加，產生過氧化反應，進而導致心肌細胞的損傷，并形成脂質過氧化物，對機體造成嚴重損害[18].SOD是一種源于生命體的活性物質，廣泛分布于動物和植物體內，具有特殊的生理活性，極強的氧化能力，能消除生物體在新陳代謝過程中產生的有害物質，對抗阻斷因氧自由基對細胞造成的損害[5].張藝瀧研究證實，SOD活性增加，氧化應激水平降低，可抑制大鼠癲癇狀態[19].研究發現，增加MDA含量，降低SOD活性，可以導致氧化應激增加，損傷小鼠心臟功能[20].另有研究表明，心肌細胞受損時，LDH和MDA水平顯著升高，SOD活性降低，抗氧化水平降低[21-22].

有關運動與心肌氧化應激的研究已有文獻報道.研究顯示，過度訓練、大強度運動心肌組織LDH和MDA表達顯著升高，SOD活性降低，氧化應激水平增加[23-24].上述研究結果表明，大強度運動氧化應激增加，損傷心肌細胞.本研究結果顯示，與C組相比，CE組LDH和MDA表達降低，SOD活性增加，表明間歇有氧運動可降低正常大鼠氧化應激水平，減少心肌損傷，改善心功能.

3.3 間歇有氧運動對大鼠心肌NOX4、ROS表達的影響

NADPH氧化酶(NOXs)是產生ROS的主要來源，有7個同源物，即NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1和DUOX2，其中NOX4型主要在心臟中高表達.NOX4可產生ROS，能催化氧還原為超氧化物，清除病原微生物，在氧化應激導致的心血管疾病、腎臟疾病中發揮重要作用[25].研究發現，在正常生理情況下，來源于NOX4的少量ROS在氧化還原信號轉導通路中發揮第二信使作用，以維持體內氧化還原反應的平衡[22]，但在高強度運動、心肌梗死、糖尿病、高血壓、缺氧等病理情況下，NOX4表達上調，催化產生大量ROS，破壞了體內氧化還原反應的平衡，從而導致機體發生氧化應激，最終導致組織器官損傷[26-28].研究證實，心梗后NOX4上調表達，誘發氧化應激，損傷心功能[29].研究表明，有氧運動可以降低2型糖尿病大鼠心肌NOX4的表達，從而減輕2型糖尿病大鼠心肌氧化應激水平[30].本研究結果顯示，與C組相比，CE組NOX4表達顯著降低，間歇有氧運動可以降低正常大鼠心肌NOX4表達，表明間歇運動可降低大鼠心肌氧化應激水平，保護心功能.

ROS是指氧的某些代謝產物和一些反應的含氧產物，由氧形成、含氧而且性質活潑的一些物質的總稱，包括超氧陰離子自由基(O2·-)和羥基自由基(·OH)以及非自由基氧化劑過氧化氫(H2O2)和單線態氧(1O2)等[31].研究表明，ROS的主要作用一方面是調節氧化應激，引發多種細胞反應，優化異常線粒體和細胞的清除，以保護損傷擴散到鄰近的線粒體、細胞和組織[32-33].另一方面，ROS不受管制的氧化和還原應激，可迅速激活氧化應激反應，導致嚴重的細胞損傷和細胞凋亡，從而導致整個器官和有機體衰竭[34-35].研究發現，大強度運動后缺血缺氧，導致心臟局部氧化應激水平增加，ROS水平增多，心肌細胞損傷加重，誘導炎性因子水平增加，導致左心室擴張，心肌組織惡性重塑，心功能下降[36-37].有研究報道，有氧運動訓練可降低心梗心臟中NOX4活性和ROS的水平，減少氧化應激[38-39].結果表明，大強度運動誘導了梗死區氧化應激水平增加，間歇運動可顯著抑制氧化應激，改善大鼠心功能.本研究結果顯示，與C組相比，CE組大鼠心肌中ROS水平顯著降低，表明間歇運動可顯著降低大正常鼠心肌ROS水平，保護心功能.

綜上，NOX4是ROS主要來源，在缺血缺氧、心梗、高血壓、糖尿病以及過度運動、大強度運動條件下，NOX4表達升高，ROS增強，氧化應激增加，造成機體功能下降.間歇有氧運動可以顯著降低大鼠心肌NOX4和ROS表達，降低氧化應激，推測間歇有氧運動可能通過下調大鼠心肌NOX4和ROS表達，降低氧化應激，改善心功能.

4 結論

間歇有氧運動可顯著改善大鼠心臟形態結構，提升大鼠心功能；間歇有氧運動可使大鼠血清MDA、LDH的含量顯著降低，SOD活性顯著增強，心肌NOX4和ROS表達顯著降低，進而降低大鼠心臟氧化應激水平，改善大鼠心功能.