PLGA導管復合骨髓間充質干細胞與細胞外基質凝膠移植修復大鼠坐骨神經缺損的生物力學分析

王懷程，李鵬，汪標文，杜純宇，于濤*

(1.吉林大學中日聯誼醫院骨關節科，吉林 長春 130031；2.吉林大學機械工程與航空學院工程力學系，吉林 長春 130022)

周圍神經損傷主要是由于牽拉傷、切割傷、火器傷、壓迫性損傷、缺血等原因導致的短暫或終生的神經功能障礙，它的病理[1]變化包括軸漿運輸受損、軸突變性、施萬細胞損傷、節段性脫髓鞘和完全瓦勒氏變性[2]。美國2009—2018年間，單上肢周圍神經損傷發生率顯著上升，年平均發病率為36.9%，2018年發病率為51.9%[3]。損傷程度較重時，自發周圍神經再生、感覺和運動功能的恢復并不完全[4]。隨著組織工程研究的發展，近期研究表明[5]：將細胞和生物材料復合支架[6]植入受損的組織進行修復治療已成為現實[7]。聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]是目前組織工程研究和應用最為廣泛的一類材料[8]。學者們對PLGA導管對周圍神經的生物學特性進行了大量的研究。 Gattermeye等[9]和Quirk等[10]研究結果表明，采用離子表面處理方法在PLGA材料表面引入功能基團或功能鏈，可提高支架材料表面的黏附性。Shen等[11]以引入陽離子化的凝膠抗基，離子處理PLGA膜，有效地改善了細胞對PLGA降解支架材料的親和性，得出了通過等離子處理的PLGA支架提高了堿性成纖維細胞生長因子(basic fibrobast growth factor，BFGF)的固化效率的結論。骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是目前細胞治療及組織工程修復的重要細胞來源[12]。學者們對以BMSCs移植干預治療神經損傷進行了大量的研究。張學磊等[13]以脫細胞異體神經導管聯合BMSCs和富血小板凝膠移植動物股神經損傷，對比分析脫細胞神經支架聯合BMSCs和富血小板凝膠移植治療兔股神經損傷的效果，得出了脫細胞神經支架聯合BMSCs和富血小板凝膠修復股神經損傷效果較好的結論。張威等[14]研究了BMSCs來源的外泌體對大鼠坐骨神經損傷的修復效果，隨機將24只SD大鼠分為三組，暴露出大鼠右側坐骨神經后，建立鼠鉗夾傷模型，Control組在相同部位注射等量磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)，Sham組僅分離出神經，Exosome組在鉗夾傷附近的神經外膜下注射5 μL外泌體。術后4周檢測大鼠運動功能的恢復情況；檢測各組大鼠電生理神經傳導功能的恢復情況；以馬松染色的方法檢測各組大鼠手術側腓腸肌的纖維面積；以透射電鏡觀察神經纖維直徑結構變化；免疫熒光染色方法對坐骨神經損傷的相應脊髓節段染色后觀察星形膠質細胞、小膠質細胞的活化數量。結果得出了坐骨神經損傷后BMSCs來源的外泌體有利于運動功能的恢復[15]，其機制和緩解疼痛與促進軸突再生有關的結論。以往的研究[13-15]均未涉及坐骨神經損傷動物模型以PLGA導管復合BMSCs與ECM凝膠移植修復后坐骨神經生物力學特性分析。PLGA導管復合BMSCs與ECM凝膠移植修復坐骨神經缺損生物力學分析罕見報道，鑒于此，作者對以PLGA導管復合BMSCs、PLGA導管復合BMSCs與ECM凝膠移植坐骨神經缺損動物模型后的動物模型大鼠，進行大體行為學觀察、坐骨神經功能指數測量、坐骨神經拉伸力學實驗，觀察PLGA導管復合BMSCs、PLGA導管復合BMSCs與ECM凝膠移植修復坐骨神經損傷動物模型的效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 6個月齡健康SD雄性大鼠36只，體質量300～308 g，購于長春高新醫學動物實驗中心[(許可證CXK(吉)2003—2004)]。ECM凝膠(BD公司，美國)、大鼠BMSCs(上海一研生物科技有限公司，中國)、PLGA(長春圣博瑪生物材料有限公司，中國)。9-0無創縫合線(青島耐克醫材有限公司，中國)。

1.2 實驗設備 MODEL55100型自動控制電子萬能試驗機(長春試驗機研究所集團公司，中國)、CGA-5型讀數顯微鏡(長春市第三光學儀器廠，中國)。Leica手術顯微鏡(德國)。

1.3 PLGA導管制作 按于濤等[16]方法將PLGA溶于二氯甲烷(7∶3)中，加入200～300 μm粒徑的NaCl做致孔劑(PLGA與NaCl質量比1∶9)混合攪拌均勻。將混合物注入內徑1.6 mm、外徑1.8 mm、長40 mm的預制模具中，室溫下使模具中的混合物在通風櫥中自然揮發，96 h后脫模，取出PLGA與NaCl柱狀導管，將導管移到真空干燥箱內。在37 ℃環境溫度下真空干燥48 h，將PLGA與NaCl柱狀導管浸入裝有800 mL離子水的燒杯中，每4 h更換1次去離子水，去離子水洗滌96 h后，將PLGA與NaCl柱狀導管取出，置于干燥箱中37 ℃干燥48 h，36 ℃環氧乙烷對PLGA與NaCl柱狀導管消毒12 h后備用。實驗前取出與NaCl與PLGA導管，使用S-5無菌塑柄手術刀切取NaCl與PLGA導管組試樣40個，試樣長10 mm。

1.4 實驗分組與方法 按Lopes等[17]方法制備動物坐骨神經損傷缺損，36只實驗動物隨機分為三組：(1)自體神經移植組12只；(2)PLGA導管復合BMSCs移植組12只；(3)PLGA導管復合BMSCs與細胞外基質(extracellular matrix，ECM)凝膠移植組12只。分別將36只實驗大鼠固定于動物手術臺上，以6%(6 mL/kg)水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，在大鼠左側股后部做正中切口，切開皮膚、皮下組織，分離半膜肌、半腱肌，使左側坐骨神經暴露并游離。在梨狀肌下緣3 mm處切除10 mm坐骨神經，制備坐骨神經10 mm的缺損模型。

1.5 坐骨神經缺損移植 按于濤等[16]的方法：(1)自體神經移植組：在手術顯微鏡下，將切除的自體坐骨神經用縫合神經外膜縫合兩斷端，每端縫合4針。(2)PLGA導管復合BMSCs移植組：取10 mm PLGA導管在手術顯微鏡下，將神經斷端分別套入PLGA神經導管，用9-0無創縫合線一針固定神經外膜和PLGA神經導管管壁，之后兩端各縫合4針。用微量注射器將大鼠BMSCs(1×109L)注入PLGA神經導管內。(3)PLGA神經導管復合BMSCs與ECM凝膠移植組：在手術顯微鏡下取10 mm PLGA導管將神經斷端分別套入PLGA神經導管，用9-0無創縫合線一針固定神經外膜和PLGA神經導管管壁，之后兩端各縫合4針，用微量注射器將大鼠BMSCs(1×109L)與外基質凝膠(1×109L)注入PLGA神經導管內。各實驗組大鼠以慶大霉素沖洗傷口后分層關閉切口，術后大鼠肢體不做外固定。待大鼠清醒后將大鼠分籠喂養，每只實驗大鼠每天腹腔注射青霉素1萬U/kg×2次，連續注射7 d，以75%酒精對大鼠皮膚切口消毒1次/d，連續消毒7 d。

1.6 坐骨神經功能測試 將大鼠置于平地，觀察大鼠術側下肢運動情況及后蹬力，判斷坐骨神經運動功能狀態。觀察大鼠對疼痛產生的反應(痛縮反應)判斷其坐骨神經感覺功能的恢復情況。

1.7 坐骨神經功能指數測定 按Baptista等[18]評價坐骨神經功能的方法，于大鼠術后每6周、12周、18周、24周測定各組大鼠正常側足(N)、實驗側足(E)的足印長度(podogram length，PL)，足印的較長距離，即從足跟到足尖的距離；足趾寬度(width between the first and fifth toes，TW)，即趾到第5趾連線距離；中間足趾距離(inter-toes distance，IT)，即第2趾到第4趾連線距離。將測量數據代入Bain公式，計算坐骨神經功能指數及其恢復率。坐骨神經功能指數=-38.3(EPL-NPL)/NPL+109.5(ETW-NTW)/NTW+13.3(EIT-NIT)/NIT-8.8，正常大鼠坐骨神經功能指數為0，坐骨神經完全離斷指標為-100。

1.8 坐骨神經取樣方法 以大鼠坐骨神經吻合處為中點，取各組實驗側(左側)同一段坐骨神經，長度約10 mm，每組各取12個坐骨神經試樣；隨機取各組大鼠右側坐骨神經12個試樣為正常對照組。試樣取出后置于裝有生理鹽水的器皿中存放備用。

1.9 坐骨神經試樣拉伸實驗方法 采用CGA-5型讀數顯微鏡測量各組坐骨神經試樣的長度和直徑，各組均長10 mm、直徑1.52～1.55 mm。按Piao等[19]的方法分別對每個坐骨神經試樣進行預調處理后進行實驗，溫度控制在(36.5±1.0) ℃內，分別將每個試樣裝夾于試驗機的夾具內，之后以5 mm/min的速度對試樣施加拉伸載荷，為使試樣在實驗中保持濕度，實驗中不斷的向試樣噴灑生理鹽水。實驗結束后，計算機自動輸出試樣的彈性限度應變、最大應變、彈性限度應力、最大應力、彈性限度載荷、最大載荷等數據和應力-應變曲線。

2 結 果

2.1 大鼠大體行為觀察結果 各組大鼠均未發現死亡，術后各組大鼠精神狀態尚可，傷口無感染，活動良好。PLGA導管復合BMSCs與ECM凝膠移植組大鼠術后14 d傷口愈合，足底皮膚有紅腫，無潰瘍，21 d后術側足趾可著地行走，后蹬力較好；自體神經移植組、PLGA導管復合BMSCs移植組大鼠術后2周發現足底皮膚有紅腫和潰瘍，4周后傷口和皮膚潰瘍愈合，術后42 d能著地行走，有跛行。術后168 d針刺患肢足底，各組大鼠均有痛縮反應。各組大鼠神經縫合處與周圍組織無黏連，遠、近端與正常神經連接處光滑無斷裂，均有纖維組織包繞，表面可見豐富的微小血管網形成，外形和正常神經相似。

2.2 坐骨神經功能指數測定 各組大鼠坐骨神經功能指數測定結果表明，術后6周PLGA導管復合BMSCs與ECM凝膠移植組神經功能恢復優于自體神經移植組、PLGA導管復合BMSCs移植組(P<0.05)；術后12周、24周各組坐骨神經功能相似(P>0.05，見表1)。

表1 各組大鼠坐骨神經功能指數測定結果

2.3 坐骨神經試樣拉伸實驗結果 PLGA導管復合BMSCs移植組、PLGA導管復合BMSCs與ECM凝膠移植組，在拉伸彈性限度載荷、彈性限應力、最大載荷、最大應力、最大應變、彈性限度應變均大于自體神經移植組，差異有統計學意義(P<0.05)；PLGA導管復合BMSCs與ECM凝膠移植組的拉伸彈性限度載荷、彈性限應力、最大載荷、最大應力、彈性限度應變大于PLGA導管復合BMSCs移植組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

表2 各組大鼠坐骨神經拉伸實驗結果

3 討 論

神經損傷動物模型是研究神經損傷的先決條件。大鼠坐骨神經結構與人類坐骨神經結構具有一定的相似性，因此本實驗采取了以下干預措施，由同一具有高級技術職稱的顯微外科醫生以手術刀切取各組用于移植的坐骨神經試樣，試樣的長度一、直徑基本一致。以無菌塑柄手術刀在每個大鼠坐骨神經相同部位切斷，形成一個10 mm缺損，復制坐骨神經缺損模型。自體神經移植組以外膜縫合法移植縫合坐骨神經，PLGA導管復合BMSCs、PLGA導管復合BMSCs與ECM凝膠組試樣，將神經斷端分別套入PLGA神經導管，將套接后縫合離斷試樣。對每個試樣均在相同的部位縫合，縫合的針數相同，對不符合要求的試樣予以剔出。由于干預措施得當，實驗結果可靠。各組大鼠行為學觀察和功能測試結果各移植組大鼠移植24周內均未發生死亡，大鼠移植手術沒有導致嚴重手術損傷、過敏反應、排斥反應，術后對大鼠針刺有痛縮反應，足底皮膚未發生嚴重潰瘍，通過PLGA導管復合BMSCs、PLGA導管復合BMSCs與ECM凝膠修復后大鼠感覺功能得到恢復。術后4周大鼠能正常著地行走，并有一定的后蹬力，說明神經的運動功能得到了明顯的恢復。

坐骨神經試樣拉伸實驗結果表明，PLGA導管復合BMSCs移植組、PLGA導管復合BMSCs與ECM凝膠移植組坐骨神經的彈性限度應變、最大應力、最大應變大于自體神經修復組，說明PLGA導管復合BMSCs與ECM凝膠移植修復動物坐骨神經損傷后起到了提高坐骨神經彈性、強度的效果，其彈性提高有利于坐骨神經抵抗變形和外力，有利于損傷的坐骨神經的修復和再生。由于坐骨神經受到損傷后打亂了神經纖維的排列關系，神經纖維受到損傷，使拉伸力學性能指標降低，拉伸力學特性發生改變，PLGA導管復合BMSCs、PLGA導管復合BMSCs與ECM凝膠移植后坐骨神經的功能得到了修復，所以力學特性也得到了恢復。

本實驗坐骨神經損傷動物模型以PLGA導管復合BMSCs、PLGA導管復合BMSCs與ECM凝膠移植干預后，動物坐骨神經的拉伸力學、生理功能等均到了一定的恢復，與所期望的結果相符。PLGA導管復合BMSCs與ECM凝膠移植對動物坐骨神經具有很好的修復效果。Piao等[20]研究化學提取脫細胞神經聯合脂肪源性干細胞移植修復坐骨神經，在移植24周時進行了電生理測試和拉伸實驗，得出了添加脂肪源性干細胞對神經功能、形態和拉伸力學功能的恢復有顯著影響。本實驗與Piao等不同，Piao等[20]是以脫細胞聯合脂肪間充值干細胞移植修復家兔坐骨神經損傷，本實驗是以PLGA導管聯合BMSCs與ECM凝膠修復大鼠坐骨神經損傷，Piao等對動物坐骨神經進行了簡單拉伸力學實驗，本實驗是對各組動物坐骨神經進行了長時間的應力松弛、蠕變特性實驗，結果更具參考價值。