耐碳青霉烯類高毒力肺炎克雷伯菌的研究進展*

孔娜娜,嚴育忠,楊德平 綜述,劉維薇△ 審校

1.上海中醫藥大學附屬龍華醫院檢驗科,上海 200032;2.上海健康醫學院附屬周浦醫院檢驗科,上海 201318

肺炎克雷伯菌(KP)是一種機會致病菌,可在尿道、呼吸道、血液和軟組織中引起傳染病。根據KP的表型和基因型特征,可將KP分為經典KP(cKP)和高毒力KP(hvKP)。hvKP的毒力高于cKP,具有獨特的表型特征(如高黏液型、特殊血清型)和基因型特征(如攜帶特殊的毒力基因),其臨床致病力更強,不僅能感染免疫功能低下的人群,還能使免疫功能正常的年輕人群發生重癥社區獲得性感染,如化膿性肝膿腫、眼內炎和腦膜炎甚至骨髓炎等。碳青霉烯類抗菌藥物作為一種廣譜抗菌藥物,是臨床治療多重耐藥革蘭陰性細菌感染的最后一道防線。近年來,這類抗菌藥物在臨床的廣泛應用導致耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)的檢出率逐年升高,CRKP已成為危害患者生命健康的重要病原體。hvKP和CRKP可通過獲得攜帶碳青霉烯耐藥基因或毒性編碼基因的質粒而進化為耐碳青霉烯類高毒力肺炎克雷伯菌(CR-hvKP),此外,cKP也可通過獲得攜帶碳青霉烯耐藥基因和高毒力基因的雜交質粒進化為CR-hvKP[1]。CR-hvKP 兼具多重耐藥和高毒力特性,其引起的感染常累及多個部位或發生侵襲性轉移,且目前缺乏有效的治療藥物[2]。CR-hvKP已經在全球范圍內傳播,對人類公共衛生構成了巨大威脅。本文對近年來CR-hvKP的研究進展進行了簡要綜述。

1 CR-hvKP的流行情況

自20世紀80年代中期以來,被稱為hvKP的特殊KP譜系在世界范圍內出現,可導致患者多部位發生轉移性傳播的化膿性感染(如肝膿腫、骨髓炎和眼內炎),甚至在免疫力強的宿主中也是如此,因此hvKP引起的感染逐漸成為全球關注的重點。近年來,由于碳青霉烯類抗菌藥物在臨床中的廣泛應用及不合理使用,碳青霉烯耐藥基因和耐藥質粒在菌株間水平傳播,全球各地陸續出現CR-hvKP感染的相關報道。2018年GU等[3]首次從肝膿腫繼發血流感染患者中分離出ST11型CR-hvKP。同年AMIR等[4]報道了一家醫院ICU內實施機械通氣的5例患者暴發CR-hvKP的院內感染,并導致4例患者死亡。2019年,KARLSSON等[5]從門診患者中分離出1株ST23型CR-hvKP,該菌株攜帶高毒力基因和碳青霉烯酶編碼質粒。2020年CHEN 等[6]對5年間住院患者的556株CRKP進行回顧性研究,分離到18株均攜帶pKPC-2耐藥質粒的CR-hvKP。2021年埃及一家醫院分離出1株同時攜帶blaKPC-2和blaNDM-1基因的CR-hvKP[7]。

不同國家CR-hvKP的 ST分型表現出一定的地域差異,美國、印度、俄羅斯、埃及、意大利等國家的CR-hvKP以ST11、ST23和ST258型為代表。亞洲是CR-hvKP感染的主要流行地區,以中國、印度和新加坡為代表,其中,中國報道的CR-hvKP感染的病例數量最多,最常見的序列類型為ST11,其次是ST23、ST25和ST65。歐洲主要的碳青霉烯耐藥基因是blaNDM、blaOXA基因,而blaKPC-2基因在美國更為普遍。在中國,CR-hvKP中廣泛存在blaKPC-2基因,在其他亞洲國家如印度、伊朗,blaOXA和blaNDM基因更為常見。日本的一項研究發現,亞胺培南水解酶(IMP)的檢出率為100%[8]。2020年,蘇丹報道了10株同時攜帶blaNDM和blaOXA-48基因的CR-hvKP[9]。此外,在過去兩年里埃及報道了2例ST11型CR-hvKP感染病例,其中1株同時攜帶blaKPC-2和blaNDM-1基因[7],而另1株同時攜帶blaKPC-2和blaOXA-48基因[10]。

2 CR-hvKP毒力影響因素

盡管世界各國對hvKP的定義未不統一,但一些遺傳特征被認為是毒力菌株的標志。這些遺傳特征主要包括2種:(1)黏液樣表型調節因子的輔助毒力因子,包括rmpA、rmpA2基因及高黏性和高毒力所必需的rmpD基因; (2)鐵載體(SPs)系統,包括有氧肌動蛋白(iucABCD)、尿囊素、大腸桿菌肌動蛋白、耶爾森菌素和沙門菌素生物合成位點[11]。其他毒力因子可能參與編碼鐵代謝和轉運,血紅素和賴氨酸轉運系統,代謝轉運蛋白和毒力基因表達、轉錄、調控蛋白質的過程[12]。

2.1莢膜多糖 在血瓊脂平板上,CR-hvKP 通常呈高黏液性,高黏液表型通常由“拉絲試驗”確定,即當某個菌落通過接種環拉伸長度>5 mm 時,拉絲試驗結果為陽性。CR-hvKP的高黏液表型通常與毒力相關。莢膜多糖是構成CR-hvKP莢膜的重要組成成分,與CR-hvKP的高黏液性密切相關,可以保護細菌免受有害環境因素的影響,并提高細菌的毒力。莢膜多糖的合成受多種基因調控,其中質粒p-LVPK上的2個質粒攜帶基因(p-rmpA和p-rmpA2)和染色體攜帶的c-rmpA基因是莢膜多糖合成的重要調節因子[13]。rmpA基因的過表達能增加KP在小鼠感染模型中的毒力,這表明高毒力表型與rmpA基因的過表達相關[14]。但也有研究表明,高黏液表型與毒力之間并無相關性。一項在中國9個地區收集28株CRKP的回顧性研究發現,其中2株不攜帶rmpA基因的CRKP的拉絲試驗結果仍呈陽性。此外,5株CRKP攜帶rmpA基因,但在拉絲試驗中結果呈陰性[15]。因此,拉絲試驗不是識別hvKP的一種靈敏、特異的方法。

根據莢膜多糖的結構和抗原性,可將KP分為多種血清型,已知的莢膜血清型有82種。目前的研究顯示CR-hvKP以毒力最強的K1 和 K2 血清型最為多見,其次是K47、K64。CR-hvKP的血清型與ST分型之間表現出一定的相關性,K1血清型以ST23型為主,K2血清型以ST65型和ST86型為主, YANG等[16]研究報道K47、K64血清型均以ST11型為主。因此,莢膜多糖可能與細菌毒力有關或可增強毒力,但并不是唯一的細菌毒性決定因素。

2.2鐵載體(SPs) SPs系統對于CR-hvKP的生長繁殖至關重要,同時也是CR-hvKP重要的毒力因子。CR-hvKP侵入宿主時可釋放SPs。SPs可從宿主體內的結合蛋白中獲得鐵離子,然后與SPs特異性受體結合,重新進入細胞。最終,CR-hvKP攝鐵生長[17]。有研究發現,較高的攝鐵能力可介導細菌毒力增強,相關的SPs有耶爾森菌素、沙門菌素、腸桿菌素和氣桿菌素[18], 其中氣桿菌素是hvKP毒力的主要決定因素,涉及的毒力基因包括irp、iro、ent、iuc、aerobactin等基因。此外,細菌菌毛介導與宿主細胞接觸或黏附于黏膜表面是CR-hvKP感染機體的重要介質,涉及的毒力基因包括fim、mrk等基因。

3 CR-hvKP的碳青霉烯類耐藥機制

造成KP對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要原因是產碳青霉烯酶,碳青霉烯酶是一種可以水解頭孢菌素類、青霉素類及碳青霉烯類抗菌藥物的廣譜β-內酰胺酶,是治療革蘭陰性菌感染的最后一道防線。近年來這類抗菌藥物在臨床的廣泛應用加速了耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌的出現,KP已成為最常見的耐碳青霉烯類腸桿菌。2016年RAFIQ 等[19]研究報道因膜孔蛋白(Omp)K36突變,在缺乏碳青霉烯類耐藥基因的情況下,hvKP表現出對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的現象。2018年浙江大學附屬第二醫院的5例術后患者在住院期間感染了攜帶KPC-2基因的K1-ST11型hvKP,患者最終因對多種抗菌藥物耐藥而死亡,該細菌被命名為ST11型 CR-hvKP[3], 通過對該細菌進行研究發現其高毒力是由約170 kbp大小的pLVPK-like毒力質粒進化而來,當敲除該質粒后其毒力大幅下降。通過對目前文獻進行總結分析,提示CR-hvKP對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機制可能存在以下4種途徑:(1)hvKP獲得碳青霉烯酶編碼質粒;(2)CRKP獲得hvKP攜帶的高毒力質粒,如pLVPK-like毒力質粒;(3)hvKP在碳青霉烯類抗菌藥物壓力誘導下Omp缺失,產生耐藥表型;(4)KP獲得具有毒力和碳青霉烯耐藥基因的融合質粒[1]。

3.1hvKP 獲得碳青霉烯酶編碼質粒 碳青霉烯類耐藥基因編碼的碳青霉烯酶在Ambler 分子分類法中屬于A、B、D類酶。A類碳青霉烯酶可以水解幾乎所有的β-內酰胺類抗菌藥物,常見的A類碳青霉烯酶包括KPC、SME、NMC-A、IMI、GES、SFC-l酶等。產KPC酶是KP對碳青霉烯類抗菌藥物最常見的耐藥機制,KPC酶有許多子類型,包括KPC-2到KPC-13。B類碳青霉烯酶又稱金屬-β -內酰胺酶,可水解帶有β-內酰胺環的各種抗菌藥物,常見的B類碳青霉烯酶主要包括NDM-1、VIM-1和IMP。D類碳青霉烯酶主要包括OXA-48和OXA-181。

CRKP攜帶可移動碳青霉烯耐藥基因的質粒、轉座子和噬菌體,這些可移動基因原件可以水平轉移到hvKP上,形成CR-hvKP。在中國和美國,KPC酶基因是最常見的碳青霉烯酶基因, KPC酶基因陽性的CR-hvKP在這些地區的報道也更多。一份報道顯示,在美國最常見的blaKPC酶基因亞型是blaKPC-2和blaKPC-3基因,在亞洲(特別是中國)和歐洲,最常見的類型是blaKPC-2基因[20]。2014年美國首次報道了一種具有高黏液表型的ST23型 KP,該菌株攜帶blaKPC-2基因,并進化為耐多藥CR-hvKP,2015年中國報道了5株K1型 hvKP通過獲得攜帶blaKPC-2基因的毒力質?；蚪Y合blaKPC-2基因的可移動DNA片段形成K1 型CR-hvKP[21]。值得注意的是,B、D類碳青霉烯酶基因的傳遞主要依賴于質粒,故它們的分布更具區域性。B、D類碳青霉烯酶主要分布在印度、伊朗等亞洲國家和俄羅斯、意大利等歐洲國家。CR-hvKP分離株大多數是OXA-48陽性菌株,其次是NDM-1和VIM-1陽性菌株。在2018年,俄羅斯研究人員首次報道了ST23型hvKP同時攜帶β-內酰胺酶CTX-M-15基因和碳青霉烯酶OXA-48基因的質粒,并進化為CR-hvKP[22]。同年,伊朗的一項調查報道了5株攜帶blaVIM-2基因的罕見K1-ST23型CR-hvKP,其中4例患者在住院期間死亡,表明此類CR-hvKP具有高毒力[4]。此外,一項中國的研究報道了一種罕見的IMP陽性菌株CR-hvKPXH210,該菌株具有ST17 KL38/O2血清型,攜帶耐藥質粒pXH210-IMP和blaIMP-4基因[22],實驗結果表明pXH210-IMP能從XH210轉移到大腸桿菌和KP受體上,說明耐藥質粒具有可轉移性。此外,XH210在小鼠感染模型中表現出高毒力,但缺乏與高毒力相關的特征標記。上述研究表明,沒有明顯高毒力表型的hvKP可以通過獲得blaIMP-4基因進化為CR-hvKP。移動基因的水平傳遞是導致KP不斷進化為CR-hvKP的關鍵因素。這些毒性菌株攜帶碳青霉烯耐藥基因表明這些主要的醫院病原體正在進化。

盡管碳青霉烯酶的分布因地理特征而異,但全球移民等因素的增加可能導致這些細菌耐藥機制與地區或城市之間的聯系發生變化。因此,在檢測CR-hvKP的相關耐藥基因時,不能忽視低流行區。CR-hvKP同時產生2種或2種以上的碳青霉烯酶可引起嚴重的傳染性疾病,導致患者病死率升高。許多國家和地區報道了這些類型的CR-hvKP,例如意大利和伊朗報道了產生NDM-1和OXA-48的CR-hvKP[23-24]。2022年埃及報道了同時攜帶blaKPC-2和blaOXA-48基因的CR-hvKP[10],該菌株分離株包含2個抗性質粒:pEBSI041-2 (blaOXA-48基因載體)和pEBSI041-3(blaKPC-2基因載體)。pEBSI041-3可以在質粒pEBSI041-2的輔助下轉移,在共轉移過程中,2個質?？梢匀诤铣?個攜帶blaOXA-48和blaKPC-2基因的更大的質粒。攜帶不同碳青霉烯類耐藥基因的質粒可以通過基因重組、重排和融合質粒的形成而進行轉移,導致CR-hvKP的耐藥機制更加復雜。

3.2CRKP 獲得hvKP攜帶的高毒力質粒 與高毒力菌株相比,多重耐藥菌株更容易通過染色體重組產生廣泛的表面多糖位點,更容易獲得毒力質粒[25]。因此,通過移動毒力基因的水平轉移,CRKP很容易進化為CR-hvKP。多項研究表明,獲得pLVPK/pLVPK-like毒力質粒后,CRKP的毒力可以顯著增強[26-27]。2018年中國一家醫院報道了ST11 CR-hvKP的暴發,5例患者感染CR-hvKP后死于嚴重肺炎,研究人員發現,所有CR-hvKP分離株的拉絲試驗結果均呈陽性,并在中性粒細胞殺傷試驗中顯示出高毒力,此外,這些CR-hvKP分離株都攜帶170 kbp的pLVPK-like毒力質粒[3]。hvKP的毒力質?？梢詥为毸睫D移到ST11型CRKP上,也可以與IncF質粒結合形成ST11型CR-hvKP[28]。有趣的是,BOLOURVHI等[24]研究報道2株CR-hvKP由攜帶非結合毒力質粒的hvKP獲得攜帶碳青霉烯耐藥基因的質粒進化而來。最新研究表明,非結合毒力質粒可以整合其他攜帶結合轉移基因的質粒,提高自身的傳播能力。當這種新的結合質粒轉移到大腸桿菌EC600或其他類型的KP時,其在小鼠感染模型中的毒力潛力可以顯著提高[29]。這些CR-hvKP在獲得毒力質粒后,表現出較強的毒力,具有高毒力傳播能力[28],更容易在醫院或社區引起暴發。

3.3Omp缺失產生耐藥表型 Omp是存在于KP等革蘭陰性菌細胞外膜上的非特導性的、能跨越細胞膜的孔道蛋白,一些抗菌藥物可經Omp進入細菌體內從而發揮殺菌作用。OmpC、OmpD、OmpE、OmpF和PhoE是臨床大腸桿菌中常見的Omp[30]。屬于OmpC家族的OmpK36和屬于OmpF家族的OmpK35在KP中很常見。在CRKP中,OmpK35和OmpK36水平的改變會產生重要影響。低水平OmpK35是超廣譜β-內酰胺酶(ESBL)產CRKP耐藥的重要機制之一。OmpK36可降低CRKP對ESBL和β-內酰胺酶(AmpC)的靈敏度,與CRKP對碳青霉烯類耐藥密切相關。僅僅缺乏Omp不會導致KP對亞胺培南耐藥,只會增加其最低抑菌濃度(MIC)。只有在合并其他抗藥性機制時,KP才能對亞胺培南耐藥,通常與高水平產ESBLs或AmpC酶耐藥機制共同作用引起KP對亞胺培南耐藥。2009年,一項對28株CRKP的研究發現,9株耐厄他培南水平較高的CRKP始終缺乏OmpK35和OmpK36[31]。對OmpK35和OmpK36基因的測序顯示,大多數分離株存在不同類型的破壞,包括點突變或插入序列(IS)突變,如IS1和IS10,這表明CRKP的碳青霉烯抗性特征可能受這些Omp突變的影響。2010年WEBSTER等[32]研究報道,同時丟失Omp K35和Omp K36可能使KP對美羅培南具有完全抗性。2015年ZHANG等[15]從血液標本中分離出的CR-hvKP,該菌株對亞胺培南高度耐藥,并證實其耐藥機制為 OmpK35、OmpK36 水平降低,并產生ESBLs。

3.4KP獲得攜帶毒力和碳青霉烯耐藥基因的融合質粒 近年來,許多研究報道了KP通過獲得雜交質粒進化為CR-hvKP。雜交質粒的形成有2個重要的機制:一種是2個單鏈片段在特殊的融合位點發生變化形成雜交質粒,另一種是同源重組形成雜交質粒[28]。有研究人員在1株K2-ST86 CR-hvKP中檢測到了融合質粒p17ZR-91-Vir-KPC[33]。p17ZR-91-KPC質粒是由攜帶blaKPC-2基因的圓形抗性質粒p17ZR-91-KPC在HR1和HR2同源區同源重組而成的。值得注意的是,p17ZR-91-Vir-KPC融合質?？梢栽诓煌蛄蓄愋偷木曛g轉移。ST11型hvKP可以通過獲得融合質粒進化為ST11型 CR-hvKP,這是最流行的ST11型CR-hvKP的進化機制。2021年在中國的1株ST11、K64型CRKP中檢測到雜交質粒pCRHV-C2244,該質粒攜帶一系列毒力基因,包括iroBCDN、iucABCD-iutA和rmpA2,以及碳青霉烯抗性基因blaKPC-2基因。質粒上的多個IS26序列可以調節攜帶blaKPC-2基因和毒力基因片段的重組,逆轉質粒上的大序列片段,最終形成雜交質粒pCRHVC2244[34]。因此,基因片段與插入元件之間的重組是雜交質粒形成的一種機制。此外,毒力質?？梢哉系饺旧w中,使細菌進化成毒力更強的菌株。2021年EGER等[35]從1例嚴重感染患者的傷口中分離出2株hvKP,全基因組測序顯示,高毒力基因iroBCDN、iucABCD/iutA、rmpA/A2和peg均位于插入染色體的特定區域。這表明毒力質粒可以整合到染色體中。進一步的分析表明,這些過程影響了染色體的功能,進化出的高毒菌株可以垂直傳播。上述菌株染色體內整合的毒力質粒表明,hvKP可以通過向其他菌株水平轉移基因進化,也可以通過垂直傳播進化。

4 CR-hvKP的治療

CR-hvKP作為耐碳青霉烯類腸桿菌(CRE)的一類細菌,目前的治療方案大多參照CRE的治療指南。碳青霉烯類抗菌藥物是治療CRE最為廣泛使用的一線藥物。美羅培南、美羅培南-法硼巴坦和亞胺培南-利巴坦通常用于兒童CRE感染疾病。總體而言,美羅培南-法硼巴坦可有效抑制產KPC酶的CRE菌株生長,具有較高的臨床治愈率和較低的副作用,特別是腎毒性較低。PASCALE等[36]指出,高劑量持續輸注美羅培南是治療特殊情況下CRE的明智選擇。然而,碳青霉烯類抗菌藥物的使用導致耐碳青霉烯類生產菌株的數量增加,增強了臨床治療的難度。一些新的抗CRE的抗菌藥物也是治療CRE感染的良好選擇,包括頭孢他啶-阿維巴坦、替加環素聯合療法和多黏菌素。使用頭孢他啶-阿維巴坦治療CRKP在臨床治愈率和生存率方面表現出良好的治療效果。然而,頭孢他啶水解活性高和OmpK35缺乏可能導致產KPC酶的ST11型 CRKP對頭孢他啶-阿維巴坦的靈敏度降低。因此,考慮到不同地區的流行病學情況和菌株產酶的特點,臨床用藥應因地制宜。

5 結語及展望

CR-hvKP在許多國家已經普遍存在,其治療選擇也相對有限。質粒的轉移及質粒在細菌間的融合和重組是CR-hvKP高突變率和高傳播率的關鍵因素。今后的研究還應關注整合到染色體上的CR-hvKP毒力質粒的垂直傳播,這可能會為研究CR-hvKP的分子機制帶來新的發現。