循環(huán)腫瘤細(xì)胞在早期肺癌診斷及預(yù)后的研究進(jìn)展*

龔 臣 綜述,閆 萍 審校

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病學(xué)呼吸內(nèi)科,廣西南寧 530021

肺癌是男性最常見的癌癥,女性肺癌發(fā)病率僅次于乳腺癌,乳腺癌每年估計(jì)有230萬(wàn)新病例(11.7%),其次是肺癌(11.4%)、結(jié)直腸癌(10.0%)、前列腺癌(7.3%)和胃癌(5.6%)。肺癌是包括中國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家的腫瘤死亡首要原因,每年估計(jì)有180萬(wàn)人死亡(18%)[1]。肺癌可分為兩個(gè)主要的細(xì)胞學(xué)亞群:小細(xì)胞肺癌(SCLC)占20%,非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占80%。NSCLC進(jìn)一步細(xì)分為腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌。由于約70%的肺癌患者確診時(shí)已是晚期,不能行手術(shù)治療,化療、放療和靶向治療是最常見的治療選擇,但5年生存率較低。對(duì)于少數(shù)早期NSCLC患者,手術(shù)治療是最常見的治療選擇,然而仍有腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,總體存活率仍然很低。

診斷肺癌的階段對(duì)預(yù)后有重大影響。然而,肺癌的及時(shí)檢測(cè)較為困難,因?yàn)榛颊咴谠缙谕ǔ]有癥狀。低劑量計(jì)算機(jī)斷層掃描(LDCT)是目前最廣泛推薦的肺癌篩查方法,但它會(huì)帶來(lái)輻射風(fēng)險(xiǎn),并且單一的LDCT檢查,在臨床實(shí)踐中,區(qū)分孤立性肺結(jié)節(jié)良惡性仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。早期腫瘤已經(jīng)出現(xiàn)潛在轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致較低存活率的一個(gè)重要因素,且選擇性治療往往基于單個(gè)腫瘤活組織表型和分子檢查,這可能低估了腫瘤異質(zhì)性,而沒有考慮腫瘤進(jìn)化和治療抵抗的能力[2]。肺癌的監(jiān)測(cè)對(duì)治療的成功至關(guān)重要,然而復(fù)發(fā)的活組織檢查通常較困難。因此,能夠識(shí)別早期出現(xiàn)的治療耐藥性并發(fā)現(xiàn)新的驅(qū)動(dòng)突變的微創(chuàng)方法對(duì)于優(yōu)化肺癌治療至關(guān)重要。這種微創(chuàng)方法被統(tǒng)稱為“液體活檢”,它利用的是腫瘤可以將細(xì)胞和分子成分轉(zhuǎn)移到血液中,在那里它們可以被識(shí)別為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)和循環(huán)游離核酸(cfNAs)。盡管在肺癌中,cfNAs的檢測(cè)已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進(jìn)展,尤其是循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)的檢測(cè),CTCs是循環(huán)系統(tǒng)外滲的腫瘤,是轉(zhuǎn)移的前體,因此,它們是包括微轉(zhuǎn)移在內(nèi)的癌癥監(jiān)測(cè)的理想目標(biāo)[3-4]。CTCs仍然是研究腫瘤生物學(xué)的重要手段,因?yàn)樗鼈兛梢杂糜诮Ⅲw內(nèi)和體外模型,用于測(cè)試新藥或藥物組合,并識(shí)別可能的耐藥機(jī)制[5]。

CTCs的分子和遺傳特性研究是一個(gè)相對(duì)較新的領(lǐng)域,在這一過程中逐漸向臨床轉(zhuǎn)化。肺癌若在早期發(fā)現(xiàn)并干預(yù),將直接影響患者的預(yù)后,本篇綜述將著重介紹CTCs在指導(dǎo)肺癌早期篩查、治療預(yù)后評(píng)估、隨訪過程中的應(yīng)用。

1 CTCs作為早期肺癌檢測(cè)的生物標(biāo)志物

由于原發(fā)腫瘤在其整個(gè)發(fā)展過程中,甚至在腫瘤發(fā)展的早期階段CTCs就能游離出原發(fā)組織[6],因此,檢測(cè)CTCs可能為早期癌癥檢測(cè)提供一種靈敏的方法。早期發(fā)現(xiàn)對(duì)肺癌患者尤其有益,因?yàn)榉伟┗颊叽蟛糠执_診時(shí)已是晚期,治療局限,且效果差。有研究表明,在168例慢性阻塞性肺疾病患者中,有5例患者檢測(cè)到CTCs,預(yù)測(cè)到隨訪后的1～4年內(nèi)會(huì)出現(xiàn)肺小結(jié)節(jié)[7]。最近,一項(xiàng)研究評(píng)估了CTCs的存在,以區(qū)分良惡性肺部病變[8]。惡性病變患者中有90%檢測(cè)到CTCs,良性病變患者中有5%檢測(cè)到CTCs。HASHIMOTO等[9]也發(fā)現(xiàn),給予Ⅰ期的NSCLC 患者術(shù)前進(jìn)行CTCs檢測(cè),發(fā)現(xiàn)17例患者檢測(cè)到CTCs,其中2例病理結(jié)果證實(shí)為肺內(nèi)轉(zhuǎn)移灶,對(duì)另外15例患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪發(fā)現(xiàn),術(shù)前CTCs陽(yáng)性與術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)。

血液中的CTCs可作為有效篩查和診斷的標(biāo)志物,以區(qū)分小的惡性肺結(jié)節(jié)和良性病變。有學(xué)者對(duì)直徑小于30 mm的肺結(jié)節(jié)患者進(jìn)行研究,分析CTCs、CT檢查特征、血清腫瘤標(biāo)志物濃度及組織病理學(xué)特征,發(fā)現(xiàn)良惡性肺結(jié)節(jié)患者的CTCs有明顯差異,聯(lián)合使用CTCs和CT確定的結(jié)節(jié)密度特征進(jìn)一步提高了惡性肺結(jié)節(jié)的診斷效果,以及TNM分期的確定[10]。循環(huán)基因異常細(xì)胞(CACs)也可以用來(lái)鑒別肺癌和良性肺部病變。使用LDCT進(jìn)行肺癌篩查在肺結(jié)節(jié)≤10 mm的患者中特異度較低,國(guó)內(nèi)一項(xiàng)多中心前瞻性研究表明,當(dāng)CACs的最佳臨界值為2時(shí),肺癌的靈敏度和特異度分別為70.5%和86.4%。提示CACs對(duì)肺結(jié)節(jié)≤10 mm有較好的肺癌診斷價(jià)值[11]。

MANJUNATH等[12]研究發(fā)現(xiàn),在所有NSCLC 患者中檢測(cè)到CTCs。在腫瘤診斷方面,目前腫瘤早期篩查主要依靠血清腫瘤標(biāo)志物和CT檢查;傳統(tǒng)檢測(cè)需要病灶形態(tài)提示高度惡性才考慮切除。CTCs從原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤脫落后在外周血中循環(huán),因此檢測(cè)不依賴于腫瘤負(fù)荷,從而使CTCs具有更高的靈敏度和特異度。CTCs在原發(fā)性肺癌診斷中的陽(yáng)性檢出率高于血清腫瘤生物標(biāo)志物。CTCs是疾病狀態(tài)的可靠指標(biāo),可作為診斷NSCLC有利的生物學(xué)標(biāo)志物。使用新的配體靶向PCR檢測(cè)技術(shù),研究了CTCs區(qū)分NSCLC與肺部良性疾病的診斷價(jià)值,檢測(cè)到的CTCs的分子表型可用于區(qū)分腫瘤類型。葉酸受體陽(yáng)性CTCs在肺癌診斷中顯示出較高的診斷效力[13]。葉酸受體陽(yáng)性CTCs與其他腫瘤生物標(biāo)志物的組合可以明顯提高區(qū)分肺癌和肺部良性疾病的診斷效能[14]。

因此,液體活檢作為一種非侵入性檢測(cè)方式,操作簡(jiǎn)單。CTCs可能是肺癌早期檢測(cè)的有效標(biāo)志物,通過檢測(cè)CTCs來(lái)早期診斷癌癥十分必要。然而,早期肺癌檢測(cè)由于所涉及的CTCs數(shù)量較少,且可能有較高的假陰性,因此,在早期肺癌檢測(cè)中使用CTCs的可行性需要一個(gè)大型的、多中心的試驗(yàn)。

2 CTCs作為預(yù)后生物標(biāo)志物

CTCs在臨床上作為預(yù)后標(biāo)志物的應(yīng)用前景廣闊。液體活檢作為監(jiān)測(cè)腫瘤遺傳學(xué)和腫瘤動(dòng)力學(xué)的新方法引起了腫瘤學(xué)的極大興趣,被證明是檢測(cè)與腫瘤復(fù)發(fā)明顯相關(guān)的微小殘留病的重要工具。使用液體活檢檢測(cè)外周血中的腫瘤成分,如血漿中的CTCs和ctDNA,已被證明是監(jiān)測(cè)實(shí)時(shí)腫瘤基因組變化的微創(chuàng)工具[15]和對(duì)治療的反應(yīng),以及調(diào)查耐藥性和評(píng)估可手術(shù)早期癌癥的腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn),最終將液體活檢整合到臨床工作流程中[16]。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)了幾種單基因檢測(cè)和多基因檢測(cè),以檢測(cè)漿細(xì)胞游離DNA的遺傳改變,用于與特定分子靶向癌癥治療相匹配的伴隨診斷[17]。這些批準(zhǔn)標(biāo)志著液體活檢在臨床上廣泛應(yīng)用的一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)。

癌癥驅(qū)動(dòng)基因突變狀態(tài)和表達(dá)特征等分子改變與早期肺癌預(yù)后有關(guān)。TNM 分期目前仍然是肺癌中使用最廣泛的預(yù)后工具。然而,分期組內(nèi)生存的變異性表明有必要尋找額外的預(yù)后參數(shù)。與此同時(shí),越來(lái)越多的證據(jù)支持表觀遺傳改變的預(yù)后價(jià)值,但基因突變與早期肺癌的預(yù)后研究鮮有報(bào)道。研究者分析了73例早期肺腺癌患者的分子譜,對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)進(jìn)行突變分析。在5.47%的患者中發(fā)現(xiàn)了EGFR突變,僅檢測(cè)到外顯子19缺失;9.58%的患者中存在KRAS突變,而只有1例患者為間變性淋巴瘤激酶(ALK)陽(yáng)性;此外,在56.16%的患者中檢測(cè)到p53的異常免疫染色[18]。總之,EGFR和KRAS突變和ALK重排的檢出率低于歐洲和亞洲國(guó)家,而p53異常表達(dá)的發(fā)生率略高。此外,鑒于該研究的樣本量較小,有必要對(duì)該患者進(jìn)行更全面的分析[18]。因此,早期肺癌亦存在基因突變,其預(yù)后價(jià)值來(lái)自歐洲早期肺癌生物庫(kù)的NSCLC標(biāo)本研究,以評(píng)估TP53、KRAS和EGFR基因突變的預(yù)后意義[19]。該研究包括11例從不吸煙者、86例既往吸煙者、152例現(xiàn)吸煙者和1例不詳吸煙狀況的患者;鱗癌110例,腺癌133例,大細(xì)胞癌或混合組織7例;該研究發(fā)現(xiàn)從冰凍的腫瘤組織中提取DNA,突變率為48.8%,TP53突變狀態(tài)與預(yù)后無(wú)關(guān);EGFR基因突變幾乎只在從不吸煙的女性中發(fā)現(xiàn);KRAS基因突變?cè)?8.5%的患者中檢出,且與疾病進(jìn)展有關(guān)。這些結(jié)果表明,突變是不同病因和組織病理形式肺癌的良好標(biāo)志物,但除了KRAS突變外,幾乎沒有預(yù)后價(jià)值,KRAS突變可能對(duì)腺癌有預(yù)后價(jià)值[19]。CTCs有望作為監(jiān)測(cè)NSCLC患者預(yù)后和復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物。在100例NSCLC手術(shù)切除患者中,48%的患者檢測(cè)到了肺靜脈循環(huán)腫瘤細(xì)胞(PV-CTC),PV-CTC、基因組分析和計(jì)數(shù)有可能成為 NSCLC 復(fù)發(fā)的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)[20]。在患者縱向監(jiān)測(cè)血液循環(huán)中的 CTCs 比放射學(xué)證據(jù)更能指示疾病復(fù)發(fā)[21]。CTCs 的分子特征可以提供基于細(xì)胞計(jì)數(shù)的有用信息。不同轉(zhuǎn)移潛能患者的 CTCs 具有特定的基因特征和不同的表達(dá)譜,可用于識(shí)別早期 NSCLC 患者的高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[22]。

手術(shù)仍然是早期肺癌患者的最佳治療策略,但這種手術(shù)干預(yù)后的評(píng)估和預(yù)警機(jī)制不夠健全。 CTCs檢測(cè)和血漿代謝物分析可能是診斷早期肺癌和識(shí)別有疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者的有效手段[23]。CTCs檢測(cè)可以識(shí)別出那些具有較高疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的肺癌患者,從而有可能讓臨床醫(yī)生確定哪些患者最有可能從手術(shù)后的輔助治療中獲益。一項(xiàng)回顧性研究表明,術(shù)前CTCs水平是NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立、靈敏的生物標(biāo)志物[24]。基于術(shù)前CTCs水平在預(yù)測(cè)NSCLC患者術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)中具有重要價(jià)值,CTCs是晚期NSCLC患者無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo),當(dāng)CTCs計(jì)數(shù)添加到完整的臨床病理預(yù)測(cè)模型時(shí),可以改善預(yù)后[25]。CTCs的檢測(cè)與早期和晚期NSCLC患者的不良臨床結(jié)局相關(guān)。轉(zhuǎn)移是NSCLC患者死亡的主要原因。然而,鑒別術(shù)后局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NSCLC患者仍然具有挑戰(zhàn)性。CTCs能準(zhǔn)確反映循環(huán)血液中腫瘤細(xì)胞微轉(zhuǎn)移對(duì)患者治療及預(yù)后的影響。

早期肺癌治療后隨訪復(fù)查CTCs對(duì)預(yù)測(cè)患者預(yù)后復(fù)發(fā)起關(guān)鍵作用。一項(xiàng)薈萃分析評(píng)估早期NSCLC液體活檢的診斷和預(yù)后價(jià)值[26],包括常見生物標(biāo)志物、CTCs、ctDNA、甲基化標(biāo)志物和microRNAs。結(jié)果提示生物標(biāo)志物對(duì)早期NSCLC的估計(jì)診斷價(jià)值在0.84～0.87。TNM Ⅰ期、T1期、N0期、腺癌、年輕和不吸煙等因素有助于降低腫瘤負(fù)擔(dān),中位細(xì)胞游離DNA水平為8.64 ng/mL。對(duì)于預(yù)后分析,微小殘留病檢測(cè)的存在是疾病復(fù)發(fā)的一個(gè)強(qiáng)有力的預(yù)測(cè)因子,從分子層面預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)到影像學(xué)監(jiān)測(cè)到疾病進(jìn)展的間隔時(shí)間為(179±74)d。因而,在臨床工作中,如果在早期肺癌隨訪過程中行液體活檢,可以提前約半年發(fā)現(xiàn)肺癌復(fù)發(fā)進(jìn)展。

程序性死亡配體1(PD-L1)表達(dá)陽(yáng)性的CTCs與早期肺癌不良結(jié)局相關(guān)。目前多項(xiàng)研究表明,CTCs與接受免疫檢測(cè)點(diǎn)抑制劑治療的NSCLC預(yù)后有關(guān)[27-29]。外周血CTCs表面含有PD-L1蛋白的表達(dá),從肺癌的早期階段分離出的CTCs預(yù)示著預(yù)后不良,并且可以通過定期隨訪來(lái)確定預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物[30],但該研究?jī)H包括36例肺癌患者,并且患者的分期并不都是早期(Ⅰ期患者僅19例)。另外一項(xiàng)擴(kuò)大樣本研究表明,對(duì)110例可手術(shù)的肺癌患者通過肺靜脈檢測(cè)CTCs,其中僅4例未發(fā)現(xiàn)CTCs[31],根據(jù)患者肺靜脈CTCs是否表達(dá)PD-L1,將患者分為PD-L1陽(yáng)性CTCs組(56/110,50.1%)和PD-L1陰性CTCs組(54/110,49.9%);單變量分析顯示PD-L1陽(yáng)性CTCs組患者的中位無(wú)病生存期縮短,PD-L1陽(yáng)性CTCs組的中位無(wú)病生存期為 16.7個(gè)月,PD-L1陰性CTCs組中位無(wú)病生存期為24.5個(gè)月,因而,CTCs中PD-L1的檢測(cè)可能為術(shù)后輔助免疫治療提供重要決策。

CTCs在肺癌放療預(yù)后中亦發(fā)揮著重要作用。對(duì)于早期NSCLC患者行立體定向放射(SBRT)治療后,監(jiān)測(cè)CTCs可能會(huì)提前預(yù)警疾病復(fù)發(fā)或進(jìn)展,治療后CTC計(jì)數(shù)陰性可能會(huì)為疾病控制提供保證[32]。CTCs分析可能有助于加強(qiáng)該人群的臨床診斷和隨訪。SBRT早期NSCLC 10%～15%的患者會(huì)局部失敗,20%～25%的患者會(huì)出現(xiàn)遠(yuǎn)處失敗。SBRT治療Ⅰ期的NSCLC患者在治療前、治療期間和治療后24個(gè)月內(nèi)連續(xù)采集標(biāo)本。結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療前,較高的CTCs和治療后CTCs的持續(xù)存在與靶向治療部位以外復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[33]。這表明CTCs分析可能會(huì)潛在地識(shí)別區(qū)域或遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高的患者,以及可能從全身治療或及時(shí)的局部區(qū)域補(bǔ)救治療中獲益。CTCs檢測(cè)可作為SBRT后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加的預(yù)后標(biāo)志物。

綜上所述,CTCs作為液體活檢在肺癌早期檢測(cè)、預(yù)后的臨床價(jià)值較高。肺癌重在早診早治,若在影像學(xué)表現(xiàn)之前和手術(shù)干預(yù)后進(jìn)行CTCs隨訪檢測(cè),對(duì)肺癌早期診斷及預(yù)后復(fù)發(fā)進(jìn)展起著非常重要的作用。