血清ADA、IL-10及TLR9與EBV相關傳染性單核細胞增多癥患兒EBV-DNA載量的相關性*

李 萍,安莉莉,韓 冰

日照市婦幼保健院兒科,山東日照 276800

傳染性單核細胞增多癥(IM)是一種單核-巨噬細胞系統急性增生性疾病,多由EB病毒(EBV)、支原體、腺病毒、巨細胞病毒等諸多病原菌感染所致[1-2]。其中EBV屬于嗜B淋巴細胞DNA病毒,EBV進入宿主體內后多附著于B淋巴細胞,是引起IM最主要的病原體之一[3]。EBV相關IM患兒典型癥狀為頸淋巴結腫大、發熱、咽峽炎三聯征,多發于學齡前與學齡期兒童。本病多呈良性、自限性,雖大部分預后良好,但仍有少數患兒會伴有噬血綜合征、周圍神經炎、肝損傷等嚴重并發癥,加之因部分患兒早期無特異性血液學表現,常與其他感染性疾病混淆[4]。因此,積極探討一種靈敏度高、特異度高的血清生物學標志物,在早期識別EBV相關IM的高危人群、評估病情程度中尤為關鍵。EBV抗體檢測是臨床診斷IM的主要方式,但存在反應弱等不足。研究發現,多種抗原提呈細胞(如樹突狀細胞、單核細胞等)表面的Toll樣受體(TLRs)于EBV感染早期可識別病毒蛋白,TLRs是機體免疫應答的主要啟動因子[5-6]。而免疫失調與炎癥反應協同作用可能是促使EBV從潛伏狀態轉變為增殖狀態,致使IM患者預后不良的重要原因[7]。基于此,本研究分析血清腺苷脫氨酶(ADA)、白細胞介素(IL)-10、Toll樣受體9(TLR9)水平與EBV相關IM患兒EBV-DNA載量的相關性,旨在為EBV相關IM的臨床診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 前瞻性選擇2021年2月至2022年12月就診于本院的98例EBV相關IM患兒作為IM組,其中男55例,女43例;年齡1～10歲,平均(4.02±1.53)歲;體重指數(20.85±1.32)kg/m2。另選同期于本院體檢的50例健康兒童(近6個月未發生病毒感染)作為對照組,其中男27例,女23例;年齡1～10歲,平均(4.18±1.65)歲;體重指數(20.57±1.28)kg/m2。IM組、對照組上述資料比較,差異無統計學意義(P>0.05),有可比性。本研究已獲院內醫學倫理委員會批準(20210013)。

1.2IM組入選標準 納入標準:符合EBV相關IM診斷標準[8];EBV特異性抗體陽性;發病時間<1周;初診;入組前未接受免疫抑制劑、抗菌藥物、糖皮質激素等治療;患兒家屬自愿簽署知情同意書。(2)排除標準:因支原體、腺病毒、巨細胞病毒等其他病原菌誘發的IM;合并扁桃體炎、肺炎等其他類型感染;生長緩慢且發育異常;伴有器質性損傷、血液系統疾病、遺傳性疾病;先天畸形。

1.3方法

1.3.1標本采集與處理 采集對照組體檢當日、IM組入院24 h內的空腹靜脈血3 mL,注入離心管,置入SCILOGEX SCI506型低速離心機(蘇州瑞諾德生物科技有限公司)上離心15 min,溫度為4 ℃,轉速為3 000 r/min,離心半徑為10 cm,取血清置于Thermo Scientific HERAfreezeTM-80 ℃超低溫冰箱(上海輔澤商貿有限公司)中待測。

1.3.2血清ADA、IL-10、TLR9水平檢測 從冰箱中取出血清標本,室溫下解凍,取血清標本放置AU640型全自動生化分析儀(日本奧林巴斯公司),利用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗(試劑盒購自上海羽哚生物科技有限公司,貨號:YDLC-4577)測定血清IL-10、TLR9水平,采用酶比色法(試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司,貨號:SNM220-NDR)測定ADA水平。

1.3.3EBV-DNA載量 利用cobas z480型全自動熒光定量PCR分析儀(瑞士羅氏公司)與配套試劑盒測定血清中EBV-DNA載量,反應總體系為20 μL,擴增條件:93 ℃ 2 min,93 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,共30個循環,EBV-DNA>500 copy/mL則為EBV-DNA陽性。參考相關標準[9]將IM組患兒分為低載量組(<6 000 copy/mL,18例)、低-中載量組(6 000～<30 000 copy/mL,25例)、中-高載量組(30 000～<300 000 copy/mL,49例)、高載量組(≥300 000 copy/mL,6例)4個亞組。

2 結 果

2.1兩組血清ADA、IL-10及TLR9水平比較 與對照組比較,IM組血清ADA、IL-10、TLR9水平升高(P<0.05)。見表1。

表1 兩組血清ADA、IL-10及TLR9水平比較

2.2血清ADA、IL-10及TLR9水平與IM發生的關系 線性回歸分析結果顯示,ADA、IL-10、TLR9水平均與EBV相關IM的發生有關(P<0.05)。見表2。

表2 血清ADA、IL-10及TLR9水平與IM發生的關系

2.3血清ADA、IL-10、TLR9水平單獨及聯合預測EBV相關IM發生的價值 將IM發生狀態(0為發生,1為未發生)作為狀態變量,將血清ADA、IL-10、TLR9水平作為檢驗變量,ROC曲線結果發現血清ADA、IL-10、TLR9水平單獨及聯合預測EBV相關IM發生的曲線下面積(AUC)為0.850(95%CI0.791～0.910)、0.867(95%CI0.811～0.924)、0.891(95%CI0.840～0.943)、0.912(95%CI0.843～0.956)。見表3。

表3 血清ADA、IL-10、TLR9水平及聯合預測EBV相關IM發生的價值

2.4IM組不同EBV-DNA載量患兒血清ADA、IL-10、TLR9水平比較 血清ADA、IL-10、TLR9水平及EBV-DNA載量從高到低為高載量組、中-高載量組、低-中載量組、低載量組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 IM組不同EBV-DNA載量患兒血清ADA、IL-10、TLR9水平比較

2.5血清ADA、IL-10、TLR9水平與EBV相關IM患兒EBV-DNA載量的相關性分析 Spearman等級相關結果顯示,血清ADA、IL-10、TLR9水平與EBV相關IM患兒EBV-DNA載量呈正相關(r>0,P<0.05)。見表5。

表5 血清ADA、IL-10、TLR9水平與EBV相關IM患兒EBV-DNA載量的相關性分析

3 討 論

EBV-DNA是來自于淋巴細胞中釋放的病毒顆粒,EBV-DNA載量可動態反映機體感染EBV后的病毒水平,故常用于原發性IM的早期診斷中。但研究發現,雖部分患兒從發病第2周后開始出現EBV-DNA轉陰,但仍有小部分患兒從發病至痊愈一直呈陰性,存在一定的漏檢率,故臨床仍需聯合其他指標進行診斷[10]。

現有研究認為,EBV進入機體后與B淋巴細胞表面受體CD21結合感染成熟B淋巴細胞,并在B淋巴細胞中建立終生潛伏感染,激活自然殺傷細胞與樹突狀細胞,進一步促進EBV增殖與細胞轉化[11-12]。且機體在受到免疫刺激、免疫抑制或慢性炎癥等因素刺激時,潛伏于B淋巴細胞中的EBV被重新活化并大量傳播、繁殖[13]。由此可見,免疫機制與EBV所致的相關疾病有關,而諸多與免疫機制相關的免疫因子、炎癥因子可能在EBV相關IM發病過程中發揮關鍵作用。B淋巴細胞表面的潛伏膜蛋白LMP1是TLR9轉錄的強抑制劑,EBV-DNA基序可激活TLR9,而漿樹突細胞可通過TLR9分子識別EBV顆粒中的線性病毒DNA。因此,干擾漿樹突細胞TLR9信號通路可通過抑制TLR9啟動子活化,活化自然殺傷細胞,抑制TLR介導的核因子-κB信號通路活化等途徑,從而削弱機體固有免疫反應,促進EBV病毒長期生存[14]。VALENTE等[15]研究發現,TLR9表達上調可促進干擾素調節因子7產生,刺激EB病毒潛伏膜蛋白1基因表達,從而促進病情進展。NOOR等[16]研究報道,TLR9主要表達于B淋巴細胞表面,EBV感染激活淋巴細胞上TLR9表達,并借助細胞因子逃避宿主的免疫殺傷作用。IL-10屬于一種抗炎因子,可抑制健康者樹突狀細胞的生長速度及向成熟活化的樹突狀細胞轉化,誘導細胞毒性T淋巴細胞對抗原產生耐受,限制機體對抗原的過度免疫反應,從而保護機體免受免疫損傷。目前已有研究證實,IL-10基因多態性與兒童EBV感染易感性、肝功能損傷有關[17-18],但關于EBV相關IM患兒血清IL-10表達及意義的報道較少。本研究中,IM組血清TLR9、IL-10水平比對照組高,TLR9、IL-10水平均與EBV相關IM患兒EBV-DNA載量呈正相關,與SKOVBJERG等[19]研究結果相似,進一步證實TLR9、IL-10水平與EBV相關IM的發生,病情程度有關,推測原因可能在于:(1)EBV感染可通過TLRs信號通路誘導機體炎癥反應,使機體識別抗原,激活免疫反應,并協助EBV的免疫逃逸,降低機體抗病毒能力;(2)TLRs可識別EBV膜蛋白,并將信號傳遞至細胞內各類接頭分子,刺激自然殺傷細胞活化,并經諸多途徑來刺激下游炎癥因子釋放,從而啟動適應性免疫應答。線性回歸分析結果顯示,TLR9、IL-10水平與EBV相關IM的發生有關(t=3.875、2.210),且進一步繪制ROC曲線發現,血清TLR9、IL-10水平預測EBV相關IM發生的AUC為0.891、0.867,當TLR9、IL-10最佳臨界值分別取2.987 ng/mL、10.521 pg/mL時,其診斷效能最高,提示臨床應高度警惕血清TLR9、IL-10水平異常升高的EBV患兒,并采取針對性治療措施,以預防IM的發生。

ADA是核酸代謝期間的關鍵酶,主要存在于淋巴細胞、胸腺、脾等組織中,不僅參與嘌呤核苷代謝過程,且與細胞免疫活性及淋巴細胞增殖密切相關。沈偉等[20]研究報道,血清ADA活性變化與異型淋巴細胞有關,EBV相關IM患兒異型淋巴細胞水平上升會釋放大量ADA。SHI等[21]在一項回顧性、大樣本量研究中共收集6 868例患兒的臨床資料,多因素Logistic回歸分析顯示,EBV感染是導致血清ADA水平升高的危險因素(OR=8.486,95%CI6.753～10.663),且ADA水平與EBV-ADA載量呈正相關(r=0.501)。本研究發現,IM組血清ADA呈高表達,且血清ADA水平與EBV-ADA載量呈正相關,與上述研究結果報道一致,推測原因可能在于:(1)細胞毒性T淋巴細胞靶向攻擊受感染的B淋巴細胞,進一步損傷B淋巴細胞功能,從而致使大量ADA被釋放入血;(2)EBV感染后會啟動T淋巴細胞對病毒抗原刺激的細胞免疫應答,激活單核巨噬細胞與淋巴細胞,造成淋巴細胞中ADA水平升高;(3)此外,EBV入侵血液系統后會形成病毒血癥,并與自然殺傷細胞、B淋巴細胞及T淋巴細胞的EBV受體結合,激活T淋巴細胞并使其變形,從而產生異型淋巴細胞。而異型淋巴細胞凋亡后會促使大量ADA被釋放,形成惡性循環。進一步繪制ROC曲線發現,血清ADA、IL-10、TLR9水平單獨及聯合預測EBV相關IM發生的AUC為0.850、0.867、0.891、0.912,提示針對臨床特征不典型,但血清ADA、IL-10、TLR9水平升高的EBV感染患兒,其罹患IM的風險較高。

綜上所述,EBV相關IM患兒血清ADA、IL-10及TLR9水平異常升高,上述指標水平與EBV-DNA載量密切相關,且三者聯合可有效預測EBV相關IM的發生。