上皮間質轉化相關基因水平評估肝癌免疫治療療效的應用價值*

韓 雪,李 帥,徐 蓉,馬文靜,黃國虹△

新疆維吾爾自治區人民醫院:1.檢驗科;2.腫瘤科,新疆烏魯木齊 830001;3.新疆維吾爾自治區烏魯木齊市中醫醫院檢驗科,新疆烏魯木齊 830002

肝癌是世界范圍內最常見的致命性惡性腫瘤,肝細胞癌約占所有肝癌90%,具有高發病率和高死亡率的特點,中國是全球肝癌高負擔國家之一,患者確診時往往進展為癌癥晚期,預后不良[1-3]。手術切除仍是治療早期肝細胞癌最有效的方法,但大多數患者在就診時已為晚期,無法切除,此外,由于手術切除后復發和轉移率較高,患者預后仍不理想,早期識別可有效預測肝癌的生物標志物對準確評估患者預后具有重要意義[4-5]。上皮間質轉化(EMT)常發生在腫瘤侵襲和轉移的開始,是惡性腫瘤侵襲轉移的早期征象,表現為上皮細胞失去上皮細胞特征,轉變為具有侵襲能力的間充質表型,從而獲得遷移行為[6]。研究顯示,EMT可作為癌癥干預的潛在靶點,并提供了初步抗腫瘤治療方向[7],但目前關于EMT相關基因評估預后的特征研究較少。基于此,本研究分析EMT相關基因水平在評估肝癌免疫治療效果方面的應用價值,以便為臨床早期干預提供理論支持。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2020年1月至2021年1月于新疆維吾爾自治區人民醫院行免疫治療的113例肝癌患者納入研究,納入標準:(1)經病理診斷符合原發性肝細胞癌患者;(2)行手術切除治療者;(3)術后接受免疫治療者;(4)年齡18～75歲者;(5)預期生存期≥1年者;(6)臨床資料完整者。排除標準:(1)合并心、腦、腎等器官嚴重功能障礙者;(2)合并其他部位惡性腫瘤者;(3)合并自身免疫、血液系統疾病者;(4)對治療藥物過敏或不耐受者;(5)合并嚴重精神-神經系統功能障礙,不能配合者。所有患者及家屬均對本研究知情,并簽署知情同意書,本研究通過新疆維吾爾自治區人民醫院倫理委員會審核并批準(批號:K20191218294)。經過1年隨訪,共有6例患者失聯,按脫落處理,最終納入患者107例。

1.2儀器與試劑 儀器:4 ℃離心機、移液槍、微量紫外分光光度儀、酶標儀(主波長450 nm,參考波長630 nm),37 ℃孵育箱等。試劑:Trizol,三氯甲烷,E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)免疫組化試劑等,全部試劑均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3方法 采用電子病歷系統收集患者年齡、性別等一般臨床資料。于術中留取生長活躍且無出血、壞死的腫瘤組織,置于-70 ℃內冰箱內保存。采用Trizol一步法提取肝癌組織塊中的總RNA,根據逆轉錄試劑盒說明合成cDNA,取2 μL逆轉錄產物進行PCR擴增,對患者肝癌組織中Snail及Twist水平進行檢測。留取部分腫瘤組織,采用PBS緩沖液清洗2～3遍后加入適量蛋白裂解液,充分研磨后提取組織中的蛋白質,采用酶聯免疫吸附試劑盒測定E-cadherin、N-cadherin水平。所有患者術后均給予免疫治療,并于患者出院后進行為期1年的隨訪,前3個月每個月于門診隨診,后每3個月于門診隨診,在隨訪終點記錄患者是否出現腫瘤復發、轉移及死亡等,并根據隨訪結果將患者分為預后良好組及預后不良組,比較兩組患者一般臨床資料及EMT相關基因水平,分析EMT相關基因水平在評估患者免疫治療預后方面的診斷價值。

2 結 果

2.1兩組患者一般資料比較 隨訪結束,預后良好組75例,預后不良組32例。預后不良組患者腫瘤最大徑大于預后良好組(t=2.183,P=0.031),而兩組患者年齡、性別等一般資料比較,差異無統計學意義(均P>0.05),見表1。

表1 兩組患者一般資料比較或n(%)]

2.2EMT相關基因水平比較 預后良好組患者的Snail、Twist及N-cadherin水平低于預后不良組(均P<0.05),E-cadherin水平高于預后不良組(P=0.001),見表2。

表2 EMT相關基因水平比較

2.3影響患者預后危險因素的Cox回歸分析 將單因素分析有統計學意義的指標帶入Cox回歸方程進行分析,結果顯示,Snail、Twist及N-cadherin水平是患者免疫治療效果不佳的獨立危險因素,E-cadherin水平則是獨立保護因素(均P<0.05),見表3。

表3 影響患者預后危險因素的Cox回歸分析

2.4列線圖模型及校正曲線 列線圖模型顯示,隨著Snail、Twist、N-cadherin水平升高及E-cadherin水平降低列線圖模型評分隨之增加,隨著列線圖模型評分升高,患者免疫治療預后不良風險升高,見圖1。列線圖模型預測患者免疫治療預后不良風險的C-index為0.923(95%CI0.876～0.943),區分度良好,經內部驗證,獲得校正曲線,結果顯示列線圖模型預測患者免疫治療預后不良風險的絕對誤差為0.016,一致性良好,見圖2。

圖1 影響患者免疫治療效果的相關因素列線圖

圖2 影響患者免疫治療效果列線圖的校正曲線

2.5影響患者免疫治療效果不佳因素的預測價值 ROC曲線結果顯示,Snail、Twist、E-cadherin、N-cadherin及4項指標聯合預測患者免疫治療效果不佳的曲線下面積(AUC)分別為0.701、0.758、0.651、0.742及0.879,4項指標聯合預測效能優于各項指標單獨預測(Z=3.402,2.522,3.894,2.987,P<0.05)。見表4。

表4 影響患者免疫治療效果不佳因素的預測價值

3 討 論

肝細胞癌是世界范圍內惡性程度最高的癌癥之一,因其具有高度異質性及高復發、高轉移率,導致肝細胞癌患者生存期較短,盡管外科和藥物治療已取得快速進展,但肝細胞癌的死亡率仍居高不下[8]。近年來免疫檢查點抑制劑的引入極大地改變了包括肝細胞癌在內的腫瘤治療方案[9-10]。但低免疫應答率可嚴重影響免疫治療療效,故在免疫治療前對患者免疫應答情況進行評估,對免疫治療的選擇及方案制訂至關重要[11]。隨著高通量測序技術和生物信息學的快速發展,越來越多的基因生物標志物被發現是疾病診斷、治療評估及預后的關鍵調控因子[12-14]。

EMT在癌細胞轉移及耐藥性中發揮關鍵作用,EMT期間,細胞失去細胞-細胞和細胞-細胞外基質的黏附,獲得間充質細胞表型,使得細胞從原發腫瘤分離[15],也有研究證實了EMT與腫瘤進展和轉移之間的聯系[16],EMT參與胚胎發生和惡性腫瘤侵襲、轉移,促進惡性腫瘤細胞侵襲并向遠處組織擴散,從而促進腫瘤轉移,既往研究證實EMT參與了肝細胞癌的進展[17-18]。而癌細胞的轉移導致90%以上的癌癥相關死亡,在EMT過程中,上皮細胞失去極性并獲得侵襲性,成為間充質干細胞[19]。Snail是著名的EMT激活轉錄因子,在腫瘤核組織、鄰近間質和瘤周炎癥中高度表達,可直接結合并抑制近端CDH1啟動子上的E-cadherin,并重塑細胞間黏附,還可抑制其他上皮標志物,并激活間充質基因。此外,EMT還能重組上皮極性分子,阻礙基底膜形成,從而促進腫瘤細胞侵襲[20]。本研究結果顯示,對于免疫治療預后不良的患者,其體內Snail水平升高,E-cadherin水平降低,提示肝癌可能發生轉移或進一步惡化,對免疫治療應答不良,從而導致患者預后欠佳。

E-cadherin主要表達于上皮細胞,E-cadherin丟失是EMT程序中最基本事件,通過Snail、Twist等EMT誘導轉錄因子抑制E-cadherin等上皮樣細胞標志物表達,同時上調N-cadherin等間質樣細胞標志物表達,促進EMT進程,從而促進癌細胞轉移[21]。Snail在EMT中作為E-cadherin表達的關鍵轉錄抑制因子,賦予腫瘤細胞癌癥干細胞樣特征,并促進耐藥、腫瘤復發和轉移[19,22]。既往動物實驗顯示,Snail表達對小鼠乳腺癌細胞中Zeb1的誘導和轉移播散至關重要,而Twist則是其他EMT轉錄因子表達所必需的,可誘導部分EMT和轉移[23]。本研究結果顯示,Snail、Twist、N-cadherin為患者免疫治療預后的獨立危險因素,E-cadherin為獨立保護因素,提示對于免疫治療療效不佳的患者,其腫瘤細胞可能發生EMT改變,而EMT相關基因高表達的患者,對免疫治療不敏感,預后不良。這與CHANG等[24]對結直腸癌患者的預后分析一致,CHANG等[24]研究表明,E-cadherin低表達與結直腸癌患者的預后不良有關,可用于預測結直腸癌患者預后。此外,MASUDA等[25]對乳腺癌患者血液中的N-cadherin的mRNA水平進行分析,結果顯示N-cadherin可作為預測乳腺癌患者轉移、復發的新型預后生物標志物。盡管針對上述指標研究的腫瘤患者群體不盡相同,但對腫瘤的預測、分析結果卻大同小異,提示Snail、Twist、N-cadherin及E-cadherin在預測腫瘤患者預后、治療療效方面具有一致性。

此外,本研究基于上述指標繪制ROC曲線,結果顯示,Snail、Twist、N-cadherin及E-cadherin聯合預測患者免疫治療效果不佳的預測效能優于各項指標單獨預測,能對患者免疫治療的療效進行有效預測,對于免疫應答率低的患者應考慮給予其他干預以改善患者預后。列線圖模型結果顯示,根據Snail、Twist、N-cadherin及E-cadherin構建的預測模型具有較好的C-index,并與實際發生的相關性較好,經內部驗證的校正曲線也表明列線圖模型可有效預測患者免疫治療療效,具有較好的臨床應用價值。

綜上所述,免疫治療療效不佳的患者其Snail、Twist、N-cadherin水平升高,而E-cadherin水平降低,4項指標聯合可有效預測患者對免疫治療的敏感性。但本研究仍存在一定不足,受限于納入樣本量,導致分析因素較少,且并未對患者進行長期隨訪,亦未對患者生存期及無進展生存期變化作進一步探究。故應進一步行多中心、大樣本、前瞻性臨床試驗,以便對患者免疫應答情況進行預測,積極給予其他干預,以延長患者生存期,改善患者預后。