GATA4和RUNX2在良性腦膜瘤組織中的表達分析及臨床意義*

李紅旗，戢翰升,王小波

湖北醫藥學院附屬隨州醫院：1.病理科；2.神經外科；3.轉化醫學研究中心，湖北隨州 441300

腦膜瘤是中樞神經系統最常見的原發性腫瘤之一，占所有原發性腦腫瘤的37%以上[1]。根據世界衛生組織(WHO)的分級標準，腦膜瘤在組織學上分為Ⅰ～Ⅲ級，其中Ⅱ級和Ⅲ級腦膜瘤具有侵襲性，為惡性腦膜瘤，80%的腦膜瘤為Ⅰ級，是良性腦膜瘤。然而，20%的Ⅰ級腦膜瘤在完全切除后會復發，這表明需要做進一步的風險分層來指導良性腦膜瘤患者隨訪期間的管理[2]。GATA結合蛋白4(GATA4)是一種鋅指轉錄因子，對早期胚胎的心臟和腸道發育非常重要，具有組織特異性，GATA4基因敲除小鼠由于心臟和腸道缺陷在胚胎發育早期死亡。研究顯示GATA4表達異常與肺癌、胃癌和鼻咽癌等腫瘤的發生、發展密切相關，既可以充當抑癌因子，又可以充當促癌因子[3-5]。符方旭等[6]報道GATA4在惡性腦膜瘤中陽性表達增加，并與患者預后不良相關。Runt相關轉錄因子2(RUNX2)也稱為核心結合因子1，已被證明是成骨細胞分化所需的主要轉錄因子，缺乏RUNX2的小鼠由于成骨細胞生成缺陷而無法進行骨化[7]。研究表明RUNX2在乳腺癌、胃癌和胰腺癌等腫瘤中發揮促癌作用，能促進細胞增殖和轉移，增強化療藥物抵抗[8-10]。但目前GATA4和RUNX2在良性腦膜瘤中的表達情況和臨床價值尚不清楚，因此本研究分析了良性腦膜瘤GATA4和RUNX2的表達情況，對GATA4和RUNX2的表達與患者預后的關系進行了探討，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2013年1月至2017年1月本院收治的100例良性腦膜瘤患者納入研究，男39例、女性61例；年齡：≤40歲42例、>40歲58例；腫瘤部位：額部41例、蝶骨嵴30例、巖骨斜坡12例、其他17例；腫瘤最大徑：≤5 cm 55例、>5 cm 45例；組織類型：上皮型32例、纖維型29例、過渡型15例、其他21例，瘤周水腫：有52例、無48例，Ki-67指數：<4% 69例，≥4% 31例。納入標準：(1)患者術前未進行化療或放療；(2)患者為首次手術切除；(3)手術后經病理切片明確診斷為WHO Ⅰ級良性腦膜瘤；(4)具備完整的臨床病理資料和隨訪資料。排除標準：(1)合并嚴重的器質性或精神性疾??；(2)合并其他原發性腫瘤；(3)術后并發癥死亡者。研究經本院倫理委員會審批通過，納入研究的患者均對本研究知情同意。

1.2儀器與試劑 Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；無水乙醇、異丙醇和氯仿購自天津風船化工試劑有限公司；反轉錄和實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)試劑購自日本Takara公司；GATA4和RUNX2的引物均由上海生工生物科技有限公司合成；槍頭和無RNA酶EP管購自美國Coring公司；PCR擴增儀器購自美國Bio-Rad公司；7500 qPCR儀購自美國ABI公司。

1.3方法

1.3.1GATA4和RUNX2表達水平的檢測 采用Trizol法提取手術切除的良性腦膜瘤和瘤旁組織的總RNA，紫外分光光度法檢測RNA純度[吸光度(A)比值A260/A280=1.9～2.1符合要求]和濃度。采用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。采用qPCR檢測組織中GATA4和RUNX2的表達水平。引物序列如下，GATA4 F：5′-CCCAATCTCGTAG ATATGTTTGAC-3′，R：5′-CCGTTCATCTTGTGGTAGAG-3′;RUNX F：5′-CCGGAATGCCTCTGCTGTTATGA-3′，R：5′-ACTGAGGCGGTCAGAGAACAAACT-3′；內參β-actin F：5′- ACTGGTCTCAGTCAGTGTACAGC-3′，R：5′-ACAGGAA GTCCCTTGCCATC-3′。采用20 μL PCR體系：SYBR Green preMix 10 μL，上下游引物各2 μL，Rox Ⅱ 0.4 μL，cDNA 1 μL，蒸餾水6.6 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共循環40次。采用2-ΔΔCT計算GATA4、RUNX2的相對表達水平。

1.3.2隨訪資料收集 對納入研究者進行5年隨訪，對患者復發情況進行記錄。

2 結 果

2.1良性腦膜瘤中GATA4和RUNX2的表達水平 良性腦膜瘤及瘤旁組織中GATA4的相對表達水平分別為1.53±0.46、0.77±0.14，RUNX2的相對表達水平分別為1.76±0.51、0.82±0.16。與瘤旁組織相比，良性腦膜瘤組織中GATA4、RUNX2的表達水平均明顯增加(t=9.21、10.73，P<0.05)。

2.2良性腦膜瘤組織中GATA4和RUNX2表達水平的相關性 Pearson相關分析顯示：良性腦膜瘤組織中GATA4和RUNX2的表達水平呈正相關(r=0.218，P=0.029)。

2.3GATA4、RUNX2表達水平與良性腦膜瘤患者臨床病理參數之間的關系 GATA4、RUNX2在良性腦膜瘤組織中的表達水平與性別、年齡、腫瘤部位、組織類型和腫瘤分期無關(P>0.05)，而與腫瘤最大徑、有無瘤周水腫及Ki-67指數有關(P<0.05)，見表1。

表1 GATA4和RUNX2在良性腦膜瘤組織中的表達水平與臨床病理參數之間的關系

2.4良性腦膜瘤組織中GATA4、RUNX2表達水平與患者預后的關系 隨訪資料顯示：納入研究的100例患者中，復發15例，5年復發率為15.00%(15/100)。GATA4高表達組和GATA4低表達組的5年復發率分別為26.67%(12/45)和5.45%(3/55)。GATA4高表達組的5年復發率顯著高于GATA4低表達組(χ2=4.645，P=0.0311)；RUNX2高表達組和RUNX2低表達組5年復發率分別為35.13%(13/37)和3.17%(2/63)，RUNX2高表達組的5年復發率顯著高于RUNX2低表達組(χ2=18.50，P<0.001)。見圖1。

注：A為GATA4表達水平對良性腦膜瘤患者預后的影響；B為RUNX2表達水平對良性腦膜瘤患者預后的影響。

2.5單因素和多因素Cox回歸分析良性腦膜瘤患者復發的危險因素 單因素和多因素Cox回歸分析顯示：GATA4高表達、RUNX2高表達、腫瘤最大徑>5 cm、有瘤周水腫和Ki67指數≥4%是良性腦膜瘤患者復發的獨立危險因素(P<0.05)，見表2。

表2 Cox回歸分析影響良性腦膜瘤患者預后的獨立危險因素

3 討 論

腦膜瘤的處理方式選擇包括觀察、手術切除和放射治療。研究顯示，即使是良性腦膜瘤也可能復發，其長期隨訪中的復發率高達47%，對于復發的患者經常需要額外的手術治療或補救性地進行放射治療，預后不良[2]。因此，預測良性腦膜瘤復發的能力是良性腦膜瘤臨床管理的關鍵組成部分。有研究表明一些差異性的分子表達與腦膜瘤的復發和進展有關，例如端粒酶反轉錄酶(TERT)啟動子突變、DNA甲基化或組蛋白H3K27me3缺失等[11]，提示研究腦膜瘤進展中發生改變的分子可能對監測良性腦膜瘤復發具有重要價值。

GATA4家族屬于鋅指轉錄因子家族，其在細胞增殖和分化中發揮重要作用。其中GATA4以高度動態的方式與共有序列結合，可以在器官發生過程中調節多種靶基因的表達，被認為是調控細胞命運的關鍵控制器。GATA4(V238G)的錯義突變導致小鼠肺結構異常和死胎，但是在人類肺癌標本中發現了GATA4啟動子的高頻甲基化，GATA4經表觀遺傳修飾后沉默，有抑癌作用[12]。ZHOU等[5]報道GATA4在鼻咽癌組織和細胞系中表達上調，并與腫瘤大小、轉移和預后不良有關，促進鼻咽癌細胞的增殖和轉移能力，表明GATA4在腫瘤的惡性進展中具有功能多樣性，在不同的腫瘤中可能發揮相反的作用。研究報道，GATA4在腦膜瘤組織中的陽性表達率增加，并且在WHO分級較高及顱外轉移的腦膜瘤組織中陽性表達率更高，并且是惡性腦膜瘤患者預后不良的危險因子[6]。大多數腦膜瘤是良性的，GATA4對良性腦膜瘤的預后判斷是否具有指導價值還不清楚。本文研究結果顯示，腦膜瘤組織中GATA4的表達水平顯著高于瘤旁組織(P<0.05)。同時，在腫瘤最大徑>0.5 cm、有瘤周水腫及Ki-67指數≥4%的良性腦膜瘤患者中GATA4的表達水平較高(P<0.05)。ZHOU等[5]報道GATA4在鼻咽癌中表達上調，并通過調節Slug信號通路促進上皮-間質轉化和轉移能力。SU等[13]報道在胰腺癌中WDR3與GATA4相互作用激活Hippo信號通路促進腫瘤的進展。Slug及Hippo信號通路在正常發育過程中發揮重要作用，同時在腫瘤中也處于激活狀態，均促進腫瘤的惡性進展，因此筆者推測在良性腦膜瘤中GATA4可能通過調控Slug或Hippo等信號通路促進腫瘤的復發，但是本課題組尚未對此進行研究，仍需后續在細胞水平進行實驗驗證及探討。本研究進一步分析發現GATA4高表達的良性腦膜瘤患者復發率較高，是患者復發的獨立危險因素，表明GATA4可作為良性腦膜瘤預后判斷的參考指標。

有研究顯示，GATA4和RUNX2共定位，并且GATA4通過在RUNX2啟動子和增強子處維持染色質開放，上調RUNX2表達水平，從而調控成人骨的形成[14]。RUNX2在乳腺癌和胃癌等多種腫瘤的疾病進展中發揮關鍵作用，促進腫瘤細胞的增殖和轉移。RUNX2在胃癌早期高表達，并與患者臨床病理特征相關，RUNX2是影響胃癌患者預后的獨立危險因素[9]。然而，RUNX2在良性腦膜瘤中的作用尚未闡明。本文研究結果顯示：腦膜瘤組織中RUNX2的表達水平顯著高于瘤旁組織(P<0.05)，提示RUNX2參與了腦膜瘤的發生、發展，可能與RUNX2的磷酸化水平增高相關，有研究報道RUNX2磷酸化后其活性增加促進乳腺癌細胞的侵襲[8]。本研究結果中，RUNX2在腫瘤最大徑>0.5 cm、有瘤周水腫及Ki-67指數≥4%的良性腦膜瘤患者中的表達水平較高(P<0.05)，與RUNX2在胃癌中的研究具有一致性，在胃癌中RUNX2通過調節yes1相關轉錄調節因子(YAP1)發揮促癌作用[9]。YAP1作為Hippo信號通路的關鍵基因，在腦膜瘤的相關研究中被報道為促癌基因[15]，而GATA4也調控Hippo信號通路[13]，因此GATA4可能通過結合并調控RUNX2的表達，激活Hippo信號通路促進良性腦膜瘤的進展。同時，本研究結果顯示良性腦膜瘤組織中GATA4和RUNX2的表達呈正相關，也能輔助證實該結論，但是具體的作用機制還需后續進一步研究。本研究結果發現，RUNX2高表達的良性腦膜瘤患者復發率較高，并且RUNX2高表達是良性腦膜瘤患者復發的獨立危險因素，表明檢測RUNX2的表達水平有助于良性腦膜瘤患者的隨訪管理。此外，本研究還顯示腫瘤最大徑>0.5 cm、有瘤周水腫及Ki-67指數≥4%均是良性腦膜瘤患者復發的獨立危險因素，與BICZOK等[16]的研究具有一致性。

綜上所述，GATA4和RUNX2均在良性腦膜瘤中表達上調，并在腫瘤最大徑>0.5 cm、有瘤周水腫及Ki-67指數≥4%的患者中表達水平更高，兩者都是良性腦膜瘤復發的獨立危險因素。