七葉皂苷鈉增效多柔比星抑制MCF-7 細胞生長和轉移

陳紅玲，陳雨甜，徐紅

蘇州大學附屬第一醫院腫瘤科，江蘇蘇州 215000

乳腺癌目前是女性死亡的主要原因[1-2]，化療是治療乳腺癌必不可少的手段，對化療藥物的耐受是影響疾病的重要因素。多柔比星（doxorubicin，DOX）作為一種重要的化療藥物，雖然有著特別強的抗腫瘤作用，但不良反應及耐藥性降低了其治愈率[3]，因此尋找一種新的、高效的、低細胞毒性的調節劑聯合化療藥物會成為乳腺癌潛在的治療策略。

從中藥娑羅子中提取的天然化合物七葉皂苷鈉（sodium aescinate，SA）已被多項研究證實具有重要的抗腫瘤作用，可協同蒽環類等藥物發揮抗腫瘤作用。SA 是兩親性的小分子，所以在藥物相互作用時可作為穩定劑發揮顯著的協同抗腫瘤效果。本研究旨在探討SA 是否可作為一種輔助藥物在乳腺癌中增加DOX 的抗癌效果及潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株與細胞培養

人乳腺癌細胞株MCF-7 購自中國科學院細胞庫。細胞在添加10%胎牛血清（fetal calf serum，FBS）（Gibco）和1%青霉素/鏈霉素（上海碧云天生物技術公司）的RPMI-1640（上海源培生物科技有限公司）培養基中培養。細胞放置于37℃，5%CO2培養箱（Thermo Fisher）中培養,采用0.25%胰蛋白酶（上海碧云天生物技術公司）消化傳代方式對MCF-7 細胞進行收集、傳代。

1.2 細胞活力分析

使用MTT實驗法進行細胞活力測定，MTT試劑購自中國索萊寶科技有限公司。將對數生長期的MCF-7細胞消化、重懸，以2500細胞/孔接種于96孔板，待細胞貼壁后更換含有不同藥物濃度的培養基。其中DOX（MCE，美國）濃度梯度為0μM、0.25μM、0.5μM、1μM、2μM，SA（APExBIO，美國）濃度梯度為0μM、20μM、40μM、60μM、80μM。每組分別培養24h、48h、72h，按照試劑說明加入MTT溶液，使用酶標儀在570nm、630nm處檢測光密度（opticaldensity，OD），并計算細胞生存率。

1.3 實驗分組

主要分為對照組、DOX處理組、SA處理組、聯合處理組，根據上述MTT實驗結果選定的藥物濃度分別為DOX0.5μM、SA40μM、DOX0.25μM+SA20μM。

1.4 細胞克隆形成實驗

使用胰酶消化重懸MCF-7 細胞并以2000 細胞/孔接種于6 孔板中，培養2d 后按實驗分組分別更換含有藥物的培養基繼續培養48h，后更換為正常培養基繼續培養10d。棄培養基，PBS 清洗，多聚甲醛（上海碧云天生物技術公司）固定，結晶紫染色。成團細胞數使用Image-J 軟件。

1.5 Transwell 實驗

細胞的遷移和侵襲能力通過Transwell實驗測定，細胞重懸于無血清的培養基并加入小室[8μMPC（聚碳酸酯）膜，康寧]的上室，下室加入600μl含有30%FBS的培養基。細胞貼壁后上室更換為含有藥物的培養基，繼續培養48h。多聚甲醛固定，結晶紫染色。用棉簽擦除上室的細胞，拍照計算。其中，遷移實驗細胞數為5×104/孔，侵襲實驗為1×105/孔，并在上室鋪放基質膠（康寧）。

1.6 實時熒光定量PCR（quantitative real-time-PCR，qRT-PCR）

使用Trizol（Invitrogen）法提取總RNA，根據新貝公司試劑說明書對RNA進行逆轉錄成cDNA，后使用SYBR Green PCR試劑盒進行擴增分析，以2-△△Ct值作為相對表達量，以GAPDH為內參。

1.7 蛋白印跡法

將RIPA裂解液∶蛋白酶抑制劑∶磷酸酶抑制劑=100∶1∶1配置成蛋白裂解液加入各組處理完成的細胞中，離心、取上清、BCA（上海碧云天生物技術公司）試劑盒檢測蛋白濃度、煮蛋白。以10～30μg蛋白樣品在10%SDS-PAGE凝膠中電泳，使用PVDF膜轉膜，5%BSA封閉，一抗CST 4℃孵育過夜，孵育二抗，顯影。

1.8 統計學方法

采用GraphPad Prism 9.0 軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，計數資料以例數（百分率）[n（%）]表示，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SA 增效DOX 抑制MCF-7 乳腺癌細胞的增殖

MTT 結果顯示，SA 能夠抑制MCF-7 乳腺癌細胞的活力，且細胞活力的抑制效果呈現濃度依賴性和時間依賴性，尤其是在72h，40～80μM 的濃度范圍內可顯著降低細胞活力，見圖1A。不同濃度DOX 同樣對MCF-7 乳腺癌細胞活力表現抑制作用，0.25～2μM 的抑制效果尤為顯著，見圖1B。聯合DOX 和SA 的MCF-7 乳腺癌細胞活力低于單獨藥物作用，表明兩種藥物組合可能產生協同抑制增殖的作用，見圖1C。對比不同時間和濃度處理下的細胞活力，單獨用藥時選用SA 40μM 和DOX 0.5μM，聯合處理時選用SA 20μM 和DOX 0.25μM，作用時間48h。

細胞克隆形成實驗的結果同樣證實 SA 與DOX 聯合作用時細胞克隆形成數量較少，即兩者能夠協同抑制 MCF-7 乳腺癌細胞增殖[對照組：（136.5±5.5）%，SA 組：（111.5±1.5）%，DOX 組：（82±6）%，SA+DOX 組：（59±4）%；F=54.27，P<0.0011]，見圖1D。

圖1 SA、DOX 對MCF-7 乳腺癌細胞增殖的影響

2.2 SA 增效DOX 抑制MCF-7 乳腺癌細胞的遷移和侵襲

Transwell 結果顯示，單獨使用SA 處理MCF-7細胞時，遷移和侵襲細胞數目的變化無明顯影響。DOX 可明顯降低乳腺癌細胞遷移和侵襲的數量，與SA 共同作用可顯著強化DOX 抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力，見圖2A、2B。通過qRT-PCR 和免疫蛋白印跡實驗進一步檢測與遷移和侵襲密切相關的上皮-間質轉化作用。其中，聯合使用SA 和DOX組細胞E-鈣黏蛋白在mRNA 和蛋白水平表達均增加，反之減少N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達，見圖2C、2D。

圖2 SA、DOX 對MCF-7 乳腺癌細胞遷移、侵襲的影響

2.3 SA、DOX 及聯合應用對MCF-7 乳腺癌細胞PI3K/Akt/mTOR 信號通路的影響

與單一用藥比較，兩者聯合應用能夠顯著促進細胞凋亡和自噬的發生，從而進一步影響細胞的生長和轉移。與DOX 單處理組比較，聯合使用SA 共處理導致PI3K/Akt/mTOR 通路中各蛋白表達水平被抑制，蛋白在磷酸化水平被顯著抑制表達，見圖3。

圖3 SA、DOX 對PI3K/AKT 信號通路的影響

3 討論

目前，針對不同類型的乳腺癌治療方式主要包括手術、化療和放療。然而，導致乳腺癌治療不成功的主要影響因素多是由于分子異質性和多藥耐藥性[3-5]。在多種化療藥物中，包括DOX 在內的蒽環類和紫杉醇類是有效且首選的藥物。其中，DOX 抗癌的作用機制主要包括抑制拓撲異構酶Ⅱ，DNA 插入和自由基產生等多種機制導致的細胞凋亡或細胞生長停滯[6-7]。近年來，隨著越來越多乳腺癌患者的暴露，許多研究也已經發現使用DOX 可誘導氧化應激、鈣超載、線粒體損傷、凋亡和自噬等導致包括心肌損傷在內的各種不良反應[4,8,9]。近年來，自噬在DOX 耐藥中的作用被廣泛研究，自噬的激活或抑制可對抗多種癌癥中DOX 的抗性[3,6]。

本研究證實，天然化合物SA 能夠促進MCF-7乳腺癌細胞對DOX 的敏感性，且對正常細胞無細胞毒性[1,6,10]。較單一使用DOX 相比，聯合SA 能夠顯著抑制細胞的增殖、遷移和侵襲能力[11]。使用較低濃度的DOX 聯合SA 能達到較高濃度的抗癌效果，且減少相應的不良反應[3]。在腫瘤生長和抑制過程中，多項研究證實信號通路PI3K/Akt/mTOR 參與調節并發揮關鍵作用[4,11-12]。同樣，實驗組處理不僅可抑制MCF-7 乳腺癌細胞的增殖和轉移，還能夠顯著抑制PI3K/Akt 信號通路。

綜上，支持SA 能夠通過PI3K/Akt 信號通路誘導MCF-7 乳腺癌細胞發生凋亡和自噬，從而增加DOX 抗腫瘤的敏感性，為臨床減少多藥耐藥及化療藥物的毒副作用提供新的見解和策略。