間歇有氧訓練激活自噬改善低氧肺動脈高壓的肺動脈重構

蘭嵐，陳阿貞，林文娟，杜建

低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary arterial hypertension，HPAH) 是一種由慢性缺氧所引起的血管性疾病，是導致肺動脈高壓的常見類型，其病理特征表現為肺血管阻力增加及重構。目前，前列環素類、內皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶抑制劑是治療肺動脈高壓的推薦藥物[1]，但它們并不能預防或逆轉疾病的進展，而有氧康復訓練作為一種非藥物干預手段已成為治療心肺疾病的重要措施，它對肺動脈高壓的治療十分有益。有氧訓練能顯著改善肺動脈高壓患者的生活質量，一定程度上延緩患者的生存期[2-5]。肺血管重構則是導致HPAH持續進展且不可逆的主要原因，而自噬又與之關系密切。故本研究從自噬調控肺血管重構的角度出發，觀察間歇有氧康復訓練對HPAH大鼠的療效，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及實驗器材 SPF 級雄性SD大鼠(體質量150～200 g)，購自上海斯克萊斯實驗有限責任公司；Beclin-1、LC3 抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；增強型RIPA裂解 液、BCA 蛋 白 定 量 試 劑、5×Protein Buffer、彩色預染中分子量蛋白質標準、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、Tris-Glycine-SDS電泳緩沖液、Western專用一抗二抗稀釋液、Western Blotting增強型蛋白印跡再生液、PVDF膜、TBS-T漂洗緩沖液購于博士德生物有限公司。冷凍離心機(JID-17R)購于廣州吉迪儀器有限公司；瓊脂糖水平電泳儀(DYCP-31DN) 購于北京六一生物科技有限公司；凝膠玻璃板、固定夾、轉移槽購于美國Bio-Rad公司；BH2光學顯微鏡(CX31)購自日本奧林巴斯公司；顯微成像掃描儀 (MGU-00003) 購于芬蘭GRUNDIUM公司；生物信息采集系統(BL-420F)購于成都泰盟科技有限公司。1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組、造模及干預 30只雄性SD大鼠適應性喂養1周后，隨機分為對照組、HPAH組及康復組，每組10只。HPAH組及康復組大鼠放置于低氧艙內進行造模[6]。低氧艙內通過充入氮氣使艙內的氧濃度保持在9%～11%，CO2濃度控制在2%以下，環境濕度保持在55%～65%，低氧時間為8 h/d，持續4周。

造模完成后，康復組大鼠進行間歇有氧康復訓練：將康復組大鼠至于運動跑臺，按照10 m/min(10 min)+25 m/min(7 min)+15 m/min(3 min)為一組，每次持續3組，運動時長共計60 min，運動1次/d，持續4周。其余組大鼠放置于靜止跑臺，與康復組同樣時長。

1.2.2 測量平均肺動脈壓(mean pulmonary arterial pressure，MPAP)及右心室肥厚指數(right ventricular hypertrophy index，RVHI) 麻醉大鼠后，用右心導管從頸外靜脈插入肺動脈干，使用生物信息采集系統檢測MPAP。取大鼠心臟，用質量濃度為0.009 g/mL的NaCl溶液沖洗干凈后修剪心臟。去除左右心房、附屬大血管及結締組織，由后室壁間溝處分離出右心室，由室間隔中部剪開分離出左心室，用濾紙吸除殘血。分別稱量右心室、左心室及室間隔質量，最后計算RVHI＝右心室質量/(左心室質量+室間隔質量)×100%。RVHI是常用衡量肺動脈高壓的指標之一。

1.2.3 HE染色 常規分離大鼠肺臟，置于10%福爾馬林溶液中，按序進行包埋、切片、脫蠟、蘇木精和伊紅染色、酒精梯度脫水、風干、封片。采用光學顯微鏡觀察每張肺組織切片的形態學特征。每組各有5張切片標本，每張標本隨機選取5個視野進行觀察比較。應用Image J軟件測量肺小動脈管 壁 厚 度(medial-wall thickness，MT)、血 管 外 徑(external diameter，ED)。計算肺小動脈重構的量化指標MT%=MT/ED×100%。

1.2.4 Western blot法檢測Beclin-1、LC3蛋白表達

提取大鼠肺組織標本，提取總蛋白并測定濃度。取等量蛋白樣品上樣，進行凝膠電泳，轉膜至PVDF膜，放置于5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，次日經TBS-T漂洗后加入二抗孵育1 h，再次漂洗后使用化學發光成像儀進行曝光成像。以GAPDH為內參，使用BandScan軟件測定各條帶的灰度值。

1.3 統計學方法 所有數據均采用SPSS 21.0統計學軟件進行分析處理，計量資料以均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 間歇有氧訓練對低氧肺動脈高壓大鼠MPAP、RVHI的影響 對照組、HPAH組、康復組MPAP分別 為(12.52 ±2.60)mmHg、(40.41 ±3.97)mmHg、(26.14±4.21)mmHg (1 mmHg＝0.133 kPa)。對照組、HPAH 組、康 復 組 大 鼠RVHI 分 別 為(21.37±3.75)%、(47.92±5.57)%、(28.09±4.43)%。與對照組 相 比，HPAH 組 大 鼠 的MPAP、RVHI 明 顯 升 高(P＜0.05)。與HPAH組相比，康復組大鼠的MPAP、RVHI水平明顯降低(P＜0.05)，見圖1。

圖1 各組大鼠的MPAP 及RVHI

2.2 間歇有氧訓練對低氧肺動脈高壓大鼠肺小動脈結構的影響 對照組大鼠肺小動脈血管內膜完整，平滑肌層及血管管腔正常。而HPAH 組大鼠肺小動脈血管內膜不完整，管壁增厚，管腔變窄，平滑肌細胞排列紊亂。經過運動康復干預后，大鼠肺小動脈管壁較HPAH 組變薄，管腔大小接近對照組，動脈內膜相對完整，見圖2。

圖2 HE染色下三組大鼠的肺臟病理學改變

同時檢測肺血管重構的量化指標MT%。結果表明，與對照組(29.38±3.07%)相比，HPAH組大鼠肺小動脈MT%(51.77±4.44%)明顯升高，提示肺小動脈管壁增厚。而與HPAH組相比，康復組大鼠MT%(40.07±2.95%)明顯下降。以上差異均具有統計學意義(P＜0.05)，見圖3。

圖3 各組大鼠肺血管重構量化指標（MT%)

2.3 間歇有氧訓練對低氧肺動脈高壓大鼠肺組織自噬標志性蛋白Beclin-1、LC3表達的影響 與對照組相比，HPAH組大鼠肺組織Beclin-1、LC3表達明顯增加(P＜0.05)；而給予間歇有氧訓練治療4周后，康復組大鼠肺組織Beclin-1、LC3蛋白表達進一步升高(P＜0.05)，見圖4。

圖4 各組大鼠Beclin-1、LC3蛋白表達情況

續圖4 各組大鼠Beclin-1、LC3蛋白表達情況

3 討論

HPAH是一種長期暴露在低氧環境中所引起的以肺血管重構與阻力增加為特征的血管性疾病，也是慢性阻塞性肺疾病、慢性肺源性心臟病、高原性肺動脈高壓等多種心肺疾病發生發展的重要病理環節，它最終會導致不可逆轉的右心衰竭，具有較高的病死率。目前治療HPAH的各類藥物均不能預防或逆轉疾病的進展。運動療法作為防治心肺疾病的重要手段，尤其是一定強度的間歇有氧運動訓練可有效改善心肺各項生理功能、增加運動耐力、提高生活質量[2-5]。本研究也證實了間歇有氧康復訓練可減輕肺動脈高壓所引起的右心室肥厚，減輕病理損傷，故可成為治療HPAH的有效方法。

缺氧可導致肺血管持續性收縮，進而發生肺血管內皮細胞受損、平滑肌細胞增殖、外膜纖維組織增多，從而引起肺血管重構[7-10]。肺血管重構是HPAH的主要病理過程，也是其持續進展的主要原因。各種干預方法若能預防和改善肺血管重構，則可以延緩病程進展、延長生存期、降低死亡率。本研究通過觀察肺組織HE染色切片發現，與正常大鼠相比，低氧導致肺小動脈血管壁和平滑肌肌層增厚、血管內膜受損、血管腔變窄，提示低氧導致肺血管重構，證實了HPAH的病理特征。而經過間歇有氧康復訓練可緩解血管重構的情況，較少肺損傷程度。

自噬是真核生物細胞在壓力條件下的自我適應機制。自噬可通過溶酶體途徑將受損蛋白質、細胞器或入侵人體內的病原體等進行降解并回收利用。正常的自噬有助于維持細胞穩態，而缺氧、炎癥反應、能量缺乏、氧化應激等多種因素則會引發異常自噬，從而打破機體細胞代謝平衡，從而導致細胞受損、凋亡而誘發疾病[11]。自噬參與了多種肺部疾病的發生與發展，其中與肺動脈高壓的病理過程關系密切。有研究表明，適當的自噬能抑制平滑肌細胞增殖，保護血管內皮屏障，維持正常的血管張力，從而抑制肺動脈高壓的形成[12]。但過度自噬則會導致肺血管持續收縮，血管內膜受損，微血栓形成，血管壁平滑肌細胞過度增殖，從而加重肺血管重構，促進肺動脈高壓進展[13]。這可能與自噬在肺動脈高壓進展的不同階段而起著不同作用相關。

自噬的發生與多種蛋白的表達變化相關。其中Beclin-1是在哺乳動物中發現的第一個參與自噬的特異性基因。Beclin-1含有BH3蛋白結構域，BH3可介導Beclin-1與Bcl-2/Bcl-xl形成復合體抑制自噬。當機體發生缺氧等情況，BH3結構域被破壞，Beclin-1 與Bcl-2/Bcl-xl 復 合 體 解 離，進 而Beclin-1參與到自噬小體的形成，故其表達強度與自噬程度呈正相關[14-15]。LC3是一種細胞質蛋白，分為Ⅰ型和Ⅱ型。當自噬發生時，LC3Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結合向LC3Ⅱ轉化，促進自噬小體形成，故LC3亦是目前公認的自噬體標志物[16-17]。因此本研究選取Beclin-1、LC3這兩個自噬相關蛋白來觀察自噬程度，證實了Beclin-1、LC3在HPAH中的表達增加，這與其他學者的研究結果一致[18-20]。同時發現經間歇有氧康復訓練治療后，Beclin-1、LC3的表達較HPAH組均進一步升高，提示通過間歇有氧康復訓練可促進缺氧誘導的肺動脈高壓大鼠的肺組織發生細胞自噬，以降低肺血管重構。

綜上所述，間歇有氧康復訓練具有促進自噬而改善肺動脈損傷、減輕肺血管重構、降低肺動脈壓力，對HPAH起到保護作用。本研究可為推廣運動康復治療提供參考。