跟腱創傷伴隨顱腦損傷后跟腱異位骨化機制研究

盧偉誠， 閆艦飛， 韓瀟瀟， 覃文聘， 高長河， 孫龍穎， 牛麗娜， 焦 凱

1.軍事口腔醫學國家重點實驗室 口腔疾病國家臨床醫學研究中心 陜西省口腔疾病臨床醫學研究中心 空軍軍醫大學口腔醫院 黏膜病科，陜西 西安 710032；2.軍事口腔醫學國家重點實驗室 口腔疾病國家臨床醫學研究中心 陜西省口腔醫學重點實驗室 空軍軍醫大學口腔醫院 修復科，陜西 西安 710032

異位骨化(heterotopic ossification，HO)是一類軟組織內部出現異常鈣化的疾病，常導致患者在肘關節或髖關節等處出現異常的板層骨結構。HO的臨床癥狀包括慢性疼痛、關節攣縮、活動受限等[1]。該疾病在軍事環境中的發病率遠高于其他環境，這一現象可能與戰場環境中的各類爆炸傷、燒傷和顱腦損傷關系密切[2]。目前，針對該疾病的主流治療方法包括放療、非甾體抗炎藥和手術治療，但治療效果極為有限且容易復發[3]。HO主要分為遺傳性HO和獲得性HO兩大類。其中，遺傳性HO包括進行性骨化性肌炎和進行性骨發育異常，主要由基因突變引起，人群發病率低[4]。獲得性HO常見于嚴重創傷、燒傷、沖擊傷或重大手術之后，其中，因中樞神經系統損傷而誘發的HO也稱為神經源性HO，由于其損傷后較高的發生率和不良的預后受到越來越多的關注。有研究報道，當中樞神經系統受到創傷后神經源性HO的發病率高達53%，遠高于其他類型的HO，但是目前對于神經源性HO的發病機制并不清楚[5-6]。有研究報道，顱腦損傷后可能會導致全身性的炎癥反應和外周器官的功能障礙，急性顱腦損傷患者合并肺損傷的發生率可達30%，損傷的中樞神經可通過釋放包含炎性小體的細胞外囊泡造成肺內皮細胞的焦亡[7-8]。細胞焦亡表現為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂，這會導致細胞內容物的釋放，進而激活強烈的炎癥反應[9]。大量研究報道，炎癥與血管鈣化等病理性鈣化的發生密切相關[10-12]，但細胞焦亡是否參與了中樞神經損傷(traumatic brain injury，TBI)導致的HO發生、發展卻少見報道。本研究通過構建TBI導致的HO動物模型，探討細胞焦亡在神經源性HO中所發揮的作用，以期為神經源性HO疾病的干預提供理論依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取42只雄性SD大鼠，6～8周齡，SPF級動物實驗室飼養。體質量200～250 g，由空軍軍醫大學動物實驗中心提供。每籠6只，飼養室溫度20℃～25℃，濕度40%～70%，光照晝夜交替12 h。所有實驗方案均通過空軍軍醫大學實驗動物中心福利與倫理委員會批準實施(批準號：IACUC-20220907)。

1.2 試劑及儀器 戊巴比妥(Sigma公司)，多聚甲醛(北京索萊寶公司)，HE染色試劑盒(北京索萊寶公司)，戊二醛，抗體GSDMD(AF4012，Affinity公司)，NLRP3(BF8029，Affinity公司)，CASPASE-1(AF5418，Affinity公司)，抗原修復試劑盒(武漢博士德)，內源性過氧化物酶阻斷劑(邁新生物)，山羊血清(邁新生物)，免疫組化二抗(邁新生物，Kit-5010)，DAB顯色試劑盒(邁新生物)，中性樹膠(北京索萊寶公司)，micro-CT(美國西門子)，腦立體定位儀，電子顱腦損傷儀eCCI(美國VUC)，透射電鏡(transmission electron microscopy，TEM)(日本JEOL公司)，微型磨鉆與配套牙科打磨機，水浴鍋。

1.3 實驗分組及跟腱創傷伴隨顱腦損傷造模 利用隨機數字表法將42只大鼠隨機分為3組，空白對照組6只，跟腱創傷組(HO組)18只，跟腱創傷伴隨顱腦損傷組(TBI組)18只。跟腱切斷均在左小腿實施，用1.5%戊巴比妥鈉(0.2 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠。麻醉成功后俯臥位固定。按時間點分為1周組、2周組、4周組3個時間點，每個時間點6只。空白對照組：無菌條件下切開表皮，顯露跟腱后不做處理，縫合表皮。HO組：無菌條件下，于踝關節后側跟腱處皮膚做一縱行切口，長約0.5 cm，顯露并鈍性分離跟腱，于跟腱中部將其剪斷，同時避免損傷周圍軟組織。跟腱不予縫合，傷口止血后縫合皮膚。見圖1。TBI組：跟腱的損傷部位與方式同HO組。跟腱損傷造模后將大鼠固定于腦定位儀，頭頂部脫毛，使用碘伏、乙醇消毒術區皮膚，在正中處切開頭頂部皮膚，剝離骨膜，顯露頂骨。在冠狀縫后5 mm處、中線旁開3 mm處定位，使用直徑4 mm的環形鉆在該點開一骨窗，顯露大鼠硬腦膜，手術過程中盡量避免損傷硬腦膜。將撞擊桿對準骨窗，設置撞擊桿的參數為下落速度3 m/s，打擊深度3 mm，打擊造成顱腦損傷。縫合頭皮后，使用紅霉素軟膏涂抹傷口，待蘇醒后放回籠中。術后肌肉注射青霉素，預防感染。肌肉注射美洛昔康預防術后疼痛，常規條件飼養，觀察。

圖1 動物模型造模(a、b.橫斷跟腱的大鼠跟腱創傷模型；c、d.大鼠顱腦損傷模型)

1.4 觀察指標

1.4.1 跟腱損傷部位micro-CT掃描 術后2、4周，大鼠麻醉后手術部位行micro-CT檢查，觀察有無創傷性HO形成。設置以下CT參數獲取圖像：掃描電壓80 keV，電流500 μA，掃描層面48 μm。掃描完成后使用專業軟件進行分析，包含HO域的閾值重建HO部分，并計算異位骨體積。通過micro-CT比較HO組、TBI組大鼠跟腱局部開始出現異位骨化的時間、異位骨化的骨密度(bone mineral density，BMD)及骨體積占比(bone volume/tissue volume，BV/TV)。

1.4.2 跟腱損傷部位組織學檢查 術后2、4周，大鼠麻醉后斷頸法處死，離斷膝關節小腿后小腿以下肢體取材，使用體積分數4%的多聚甲醛固定24 h，EDTA脫鈣液脫鈣3周，脫鈣完全后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，透明石蠟包埋，6 μm厚度切片。(1)通過蘇木素伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色比較HO組、TBI組跟腱處異位骨化的骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)：取石蠟切片烤片3 h，二甲苯結合梯度乙醇脫蠟，蘇木素染色，流水沖洗，1%鹽酸乙醇分化液分化后伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后，樹脂封片，拍照觀察。(2)通過免疫組化檢測跟腱創傷局部的焦亡相關蛋白的表達水平：取石蠟切片脫蠟后，抗原修復液修復，使用內源性過氧化物酶阻斷內源性氧化物，血清封閉后一抗(抗體GSDMD，1∶200稀釋；抗體NLRP3，1∶200稀釋；抗體CASPASE-1，1∶200稀釋)4℃孵育過夜，PBS沖洗切片，滴加二抗，室溫放置0.5 h，PBS沖洗后使用DAB顯色液顯色。自來水沖洗DAB溶液。蘇木素細胞核染色，分化后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，觀察拍照。(3)通過TEM檢測HO組、TBI組大鼠跟腱局部早期的病理性礦化：取新鮮的跟腱樣品，2.5%戊二醛固定后電鏡超薄切片，TEM觀察。

2 結果

2.1 實驗動物數量分析及一般情況 42只大鼠造模后全部存活，傷口無感染，愈合良好，無行動障礙，全部進入數據分析。

2.2 大鼠跟腱損傷局部micro-CT掃描結果 TBI組術后2周跟腱創傷處可見明顯的圓形片狀高密度影，同期HO組損傷跟腱中無HO形成(圖2a、c)；術后4周TBI組和HO組均有HO形成(圖2b、d)，TBI組BMD及BV/TV均大于HO組，差異有統計學意義(P<0.05，圖2e、f)。

圖2 HO組、TBI組大鼠跟腱創傷部位的micro-CT表征[a、b.HO組在2周和4周micro-CT結果(比例尺=5 mm)；c、d.TBI組在2周和4周micro-CT結果(比例尺=5 mm)；e.HO組、TBI組BMD比較；f.HO組、TBI組BV/TV比較]

2.3 大鼠跟腱損傷局部HE染色結果 造模2周后，HO組表現為成纖維細胞雜亂排列，TBI組跟腱創傷中可以觀察到軟骨基質形成(圖3a、c)，造模4周后，HO組與TBI組中均可見成熟骨組織、骨小梁及骨髓腔結構，但是HO組異位骨化的骨小梁厚度僅為(0.037±0.004)mm，低于TBI組的(0.084±0.007)mm，兩組比較，差異有統計學意義(t=20.89，P<0.05)。見圖3b、d、e。

圖3 HO組、TBI組大鼠跟腱創傷部位的HE表征[a、b.HO組2周和4周跟腱創傷局部HE染色結果(比例尺=100 μm)；c、d.TBI組2周和4周跟腱創傷局部HE染色結果(比例尺=100 μm)；e.HO組、TBI組Tb.Th比較]

2.4 大鼠跟腱損傷局部組化染色結果 造模1周后，通過免疫組化技術檢測焦亡相關標志，明確跟腱組織損傷后細胞焦亡情況，發現TBI組大鼠與HO組大鼠比較，損傷跟腱組織中的NLRP3+(t=9.22，P<0.05)、CASPASE-1+(t=20.61，P<0.05)、GSDMD+(t=19.87，P<0.05)的細胞均顯著增加。見圖4。

圖4 HO組、TBI組大鼠跟腱創傷局部焦亡的免疫組化表征[a、b.造模1周后跟腱創傷局部的NLRP3蛋白組化表征結果(比例尺=200 μm)；c、d.造模1周后跟腱創傷局部的CASPASE-1蛋白組化表征結果(比例尺=200 μm)；e、f.造模1周后跟腱創傷局部的GSDMD蛋白組化表征結果(比例尺=200 μm)；g.HO組、TBI組NLRP3+細胞數目比較；h.HO組、TBI組CASPASE-1+細胞數目比較；i.HO組、TBI組GSDMD+細胞數目比較]

2.5 大鼠跟腱損傷局部TEM結果 造模1周后，斷裂跟腱處的微觀結構觀察可以發現，在HO組的細胞基質中出現針狀的鈣磷沉積，同時期的TBI組中同樣發現類似高密度的鈣化結構，該結構的形狀更大，成團狀。見圖5。

圖5 造模1周后HO組、TBI組大鼠跟腱創傷局部鈣磷結晶的TEM表征[a.造模1周后HO組局部鈣磷結晶的TEM表征結果(比例尺=400 nm)；b.造模1周后TBI組局部鈣磷結晶的TEM表征結果(比例尺=400 nm)]

3 討論

本研究發現，TBI組較HO組更易出現HO且骨化程度更加嚴重，這一結果與臨床病例相吻合，因此，本研究構建的TBI模型可以較好地模擬臨床神經源性HO的發生、發展，同時，該模型的構建也為筆者進一步探究顱腦損傷后HO的發生機制打下良好的基礎。

目前認為，HO的形成是3個關鍵因素共同作用的結果：參與HO形成的前體細胞、啟動異位成骨的分子信號、創傷誘導的炎癥微環境[13]。顱腦損傷可顯著提升機體的炎癥水平，從而顯著促進局部HO的發生。本研究發現，顱腦損傷后跟腱創傷局部高表達焦亡通路相關蛋白NLRP3、CASPASE-1和GSDMD，與Kerr等[9]報道的TBI誘發肺部細胞焦亡的發現相類似，證實了顱腦損傷與外周細胞焦亡間的聯系。有研究報道，顱腦受到創傷后，處于炎癥狀態和瀕死狀態的神經細胞會釋放大量包含炎癥小體或者其他炎性物質的細胞外囊泡，這些囊泡可以通過血腦屏障進入到外周循環系統中，進而導致外周炎癥水平上升，當被外周細胞攝取這些囊泡后還會誘發細胞焦亡的發生[14-15]。因此，筆者推測跟腱創傷局部的細胞焦亡很可能是經由顱腦創傷后神經來源細胞外囊泡介導，但是有待進一步實驗驗證。

非膠原蛋白、核酸等生物大分子具有穩定鈣磷離子、形成無定形礦化前驅體介導鈣化形成的作用，在生理性礦化和病理性礦化中發揮重要作用[16]。有研究證實，細胞外核酸可以吸附在膠原纖維上并可以進一步吸附鈣磷，誘導纖維內礦化的發生[17]。凋亡細胞釋放的凋亡囊泡，同樣具有礦化成核位點的作用，這些囊泡可以從細胞外液中吸附鈣磷并沉積，形成微小的鈣化結晶，隨后繼續富集細胞外液中的鈣磷，生長變大成為鈣化結節[18]。細胞焦亡后能夠釋放出大量的細胞外核酸、蛋白等細胞內容物來充當成核位點，因此焦亡可能在病理性礦化形成中發揮了重要作用，但是具體機理仍有待深入探索[19]。

本研究中，HO組與TBI組在HO的形成階段都遵循軟骨內成骨的成骨方式[20]，后期的HO組織都趨向于成熟骨樣結構，在這個過程上具有一定相似性，因此造成兩個實驗組HO形成差別的原因可能是早期的炎癥水平或者是局部細胞死亡水平的差異。顱腦損傷后局部增強的細胞焦亡現象可能會誘導局部產生更多的鈣磷結晶。納米級別的鈣磷結晶本身就具有一定的誘導HO的能力，一方面可以通過吸附鈣磷不斷沉積變大，另一方面可以促進周圍細胞向成骨方向分化[21]。還有學者認為，微小的鈣磷結晶會導致基質的硬度發生改變，硬度較大的基質又可以誘導間充質干細胞向成軟骨成骨方向分化，進一步促進HO[22]。

本研究成功構建出大鼠的神經源性HO動物模型，可以有效模擬臨床上的神經源性HO的病理狀態。在此模型的基礎上，筆者觀察到TBI大鼠跟腱創傷局部的細胞焦亡和鈣磷沉積，這一發現將為后續研究HO的阻斷提供一個新的思路，即對神經源性HO形成早期的細胞焦亡進行阻斷，提高病患預后質量，避免該疾病阻礙傷病員重返崗位，有力提高官兵戰斗力。但是，目前實驗取材時間點的分組較少，無法準確監測HO形成的全部過程。下一階段的探索中會增多時間分組，更詳細研究HO形成的整個過程。同時，關于焦亡在骨化形成中的發揮的具體作用并未深入探索，探明細胞焦亡與神經源性HO之間的關系，將為從病理生理層面理解神經源性HO提供更多的實驗支持。

綜上所述，顱腦損傷顯著加速跟腱創傷局部HO進程，其機制可能與細胞焦亡提高局部炎癥水平，進而加重HO的發生相關。