外周血循環腫瘤細胞、EB病毒DNA水平對鼻咽癌患者預后預測價值

黃偉義， 梁錦輝， 劉家豪， 鄧 濱， 董良哲， 程宇文， 羅泳林， 顏建業， 寧錦燕， 陳 永

梧州市紅十字會醫院 腫瘤科，廣西 梧州 543200

鼻咽癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，早期不易被發現，80%的患者就診時已為中晚期。放射治療是鼻咽癌的主要治療方法[1]，調強放療后患者5年總存活率可達80%以上，但仍有約30%的患者治療失敗，主要原因為局部區域復發和遠處轉移[2]。測定患者鼻咽癌組織或血清、血漿中分子標志物，預測治療后復發、轉移危險度，精準識別高危患者，有利于早期對患者進行個體化治療，從而降低復發率和轉移率，改善患者預后[3-4]。目前，多數鼻咽癌相關轉移標志物存在敏感性差、特異性差的問題，進一步尋找具有較高敏感性、特異性的標志物尤為重要[5]。外周血循環腫瘤細胞(circulating tumorcells，CTCs)、EB病毒DNA(EB virus DNA,EBV-DNA)水平與鼻咽癌復發、遠處轉移密切相關，監測CTCs可早于常規影像學檢查手段預估腫瘤復發風險[6]。本研究旨在探討外周血CTCs、EBV-DNA水平對鼻咽癌患者預后的預測價值。現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取自2018年3月至2019年3月梧州市紅十字會醫院收治的100例鼻咽癌患者為研究對象。納入標準[7]：(1)經病理組織學確診為鼻咽癌；(2)入組前未接受過手術或局部放化療治療；(3)預計生存期>6個月。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)合并心、肝、腎等臟器功能衰竭；(3)不愿配合本研究。其中，男性54例，女性46例；年齡32～75歲，平均(48.8±4.6)歲；病理類型：低分化型37例，中分化型48例，高分化型15例；T分期：T1期22例，T2期34例，T3期24例，T4期20例；臨床分期：ⅢB期58例，Ⅳ期42例。本研究經醫院倫理委員會批準。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 治療方法 Ⅰ～Ⅱ期患者接受根治性放療；Ⅲ～Ⅳ期患者接受 2～3個周期的誘導化療(PF/TPF/GP方案)，然后行根治性同步放化療，鼻咽部劑量為68～70 Gy/33 F，頸部陽性淋巴結劑量為66～70 Gy/33 F，預防照射劑量為54 Gy/33 F。

1.2.2 CTCs檢測方法 采集患者清晨空腹靜脈血5 ml，EDTA抗凝。微孔濾膜過濾法分離外周血CTCs，采用專用的細胞染色液進行染色，CTCBIOPSY?檢測系統購自武漢友芝友醫療科技有限公司。原位雜交技術檢測EB病毒編碼的RNAs(EBERs)，確定受檢外周血中鼻咽癌CTCs及其數量，EBERs原位雜交試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。將貼有濾膜的載玻片依次放入100%乙醇、95%乙醇、75%乙醇中脫色；0.4%胃蛋白酶消化10 min；EBERs探針雜交過夜；信號檢測采用過氧化物酶結合抗地高辛抗體和3,30-二氨基聯苯胺；蘇木精復染。陽性信號呈棕黃色，局限于細胞核內。

1.2.3 CTCs判斷標準 在光學顯微鏡下觀察CTCs形態學特征。(1)細胞體積較大，呈圓形、橢圓形或梭形，長徑>10 μm。(2)細胞核異型性，呈折疊、扭曲、結節或分葉狀等；核深染且著色不均勻，核膜增厚，出現凹陷或褶皺；核偏位，或巨大核仁。(3)多數核質比>0.8。同一個標本中符合上述標準的細胞≥2個為CTCs陽性[8]。

1.2.4 EBV-DNA測定 在10%胎牛血清中培養CNE1鼻咽癌細胞系，分別加入100 U/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素，以含EBV B95-8細菌株構建BAC質粒，設計EBER1同源重組正向引物，按照Trizol法提取鼻咽癌細胞EBV-RNA并進行逆轉錄，根據CFX-96 PCR系統設計反應引物，采用熒光定量PCR測定EBV-DNA。

1.3 觀察指標 隨訪12.5～33.4個月，中位隨訪時間為25.6個月。記錄患者無進展生存期(progression free survival，PFS)、總生存期(overall survival，OS)。

2 結果

2.1 患者局部復發和(或)轉移發生情況 將CTCs和(或)EBV-DNA陽性的患者納入陽性組(n=81)，將CTCs和EBV-DNA陰性的患者納入陰性組(n=19)。陰性組治療前、治療后1個月、治療后3個月的局部復發和(或)轉移發生率均低于陽性組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 患者局部復發和(或)轉移發生情況/例(百分率/%)

2.2 CTCs陰性與陽性患者PFS、OS比較 CTCs陽性患者PFS、OS分別為(4.22±0.98)個月、(7.14±1.02)個月，均短于CTCs陰性患者的(7.14±1.02)個月、(18.36±2.47)個月，差異均有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

鼻咽癌發生與遺傳有關，同時受環境、病毒等因素的影響，最后于鼻咽位置形成腫瘤[9]。臨床多選擇手術、化療等方式對其進行治療[10]。有研究報道，80%的鼻咽癌患者可通過對癥治療達到控制病情的目的，同時延長生存時間[11]。在此期間，臨床可通過監測病理參數分析患者病情，如CTCs、EBV-DNA等[12]。與腫瘤組織樣本比較，血液樣本更易獲取、創傷性小、可反復采集，是臨床常規檢測較為理想的標本來源[13]。有研究報道，CTCs檢測有助于腫瘤復發轉移監控，判斷患者預后，可指導術后輔助治療等[14]。CTCs常以多種形態分布在機體的外周血內，即可呈單個游離狀態，也可聚集成團，同時可隨著血液進入淋巴系統，轉移腫瘤細胞[15]。

本研究中，CTCs和EBV-DNA陰性患者治療前、治療后1個月、治療后3個月的局部復發和(或)轉移發生率均低于CTCs和(或)EBV-DNA陽性患者。CTCs變化可以反映腫瘤的增殖活性及對治療的敏感性，CTCs持續增多提示腫瘤復發或轉移[16]。EBV-DNA作為診斷鼻咽癌的重要方式，能夠觀察到EB病毒的DNA情況，若結果顯示陽性，提示患者機體中存在EB病毒感染，需及時采取對應的抗病毒藥物進行治療[17]。有研究報道，EBV-DNA作為非洲淋巴細胞瘤病毒，其水平一旦>500份/mm，提示患者預后極差[18]。此外，治療后腫瘤轉移或復發患者的治療前血漿EBV-DNA拷貝數較未出現臨床進展患者高，治療前血漿EBV-DNA水平可以作為鼻咽癌患者預后的獨立預測因素，血漿EBV-DNA水平每升高10倍，腫瘤遠處轉移和局部復發的危險度就會增加[19-21]。

本研究結果顯示，陰性組治療前、治療后1個月、治療后3個月的局部復發和(或)轉移發生率均低于陽性組，提示CTCs和(或)EBV-DNA陽性為腫瘤遠處轉移和局部復發的危險因素，可以作為鼻咽癌患者預后的獨立預測因素。本研究從鼻咽癌患者化療結束后隨訪至2020年6月，隨訪結束時，化療前CTCs陽性患者PFS、OS短于CTCs陰性患者(P<0.05)，提示CTCs為腫瘤遠處轉移和局部復發的危險因素，可以作為鼻咽癌患者預后的獨立預測因素。

綜上所述，CTCs、EBV-DNA陽性鼻咽癌患者的局部復發和(或)轉移發生率升高，CTCs、EBV-DNA陽性提示預后不良。