沙棘異功方中總黃酮的純化及抗氧化活性研究

萬鵬聰，張俊，杜晨暉，梁惠珍，裴香萍

山西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥與食品工程學(xué)院（晉中 030619）

沙棘異功方是以《小兒藥證直訣》中的經(jīng)典方“異功散”為基礎(chǔ)，由沙棘、炙甘草、陳皮、黨參、炒白術(shù)、茯苓等藥味組成，具有健脾消食、行氣化滯、止咳祛痰的功效，臨床用于治療因小兒脾胃氣虛引起的食積、厭食、咳嗽等癥。方中多數(shù)藥味所含的總黃酮成分具有良好的抗氧化能力[1-8]。而且益氣健脾中藥（如黨參、甘草）中的黃酮類成分對(duì)修復(fù)胃腸黏膜損傷有較好的藥理活性，可用于治療胃腸疾病[9]。沙棘中的黃酮類成分（如原花青素類）對(duì)應(yīng)激性胃潰瘍具有保護(hù)作用[10]。廣陳皮中的多甲氧基黃酮類化合物（如川陳皮素和橘皮素）能夠增強(qiáng)腸蠕動(dòng)，具有促消化功能[11]。文章采用大孔樹脂吸附法對(duì)沙棘異功方水提取物中的總黃酮進(jìn)行分離純化，并比較分析大孔樹脂純化前后總黃酮的抗氧化能力，為后續(xù)有效部位的藥效學(xué)試驗(yàn)研究提供理論依據(jù)，也為以該復(fù)方為基礎(chǔ)研發(fā)的相關(guān)制劑研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CP214分析天平（奧豪斯儀器有限公司）；ALC-210.4電子分析天平（上海精密儀表有限公司）；HH-2恒溫水浴箱（金壇市杰瑞爾有限公司）；BGZ-30數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；SB-800 DTD超聲清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Ultra-3660型紫外可見分光光度計(jì)（北京普源精電科技有限公司）。

1.2 藥材與試劑

炙甘草、黨參、陳皮（山西元和堂中藥有限公司）；炒白術(shù)、茯苓（山西維康堂中藥飲片有限公司）；沙棘（新疆塔城誠信藥業(yè)），由山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室的裴香萍教授鑒定，均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版一部項(xiàng)下規(guī)定。蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-202012，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

無水乙醇（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；亞硝酸鈉（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）；硝酸鋁（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（天津市北辰方正試劑廠）；鄰二氮菲、硫酸亞鐵（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；雙氧水（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，上海伊卡生物技術(shù)有限公司）；2, 6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT，北京索萊寶科技有限公司）；磷酸緩沖溶液（PBS溶液，北京索萊寶生物科技有限公司）；水為蒸餾水，試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的含量測(cè)定方法

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

取5.15 mg蘆丁對(duì)照品，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備

按照處方比例稱取36 g沙棘、24 g炙甘草、24 g陳皮、24 g黨參、24 g炒白術(shù)、24 g茯苓，加10倍量水，煎煮2次，每次30 min，濾過，合并濾液，濃縮，濃縮液置1 000 mL容量瓶中，加水定容至刻度，再精密量取500 mL，置1 000 mL容量瓶中，加水定容至刻度，即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[12]

精密量取0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0和2.4 mL對(duì)照品溶液，分別置10 mL帶塞試管中，各加水至2.4 mL，加0.4 mL 5% NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min，加0.4 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min，加4 mL 4% NaOH溶液，再加2.8 mL水，搖勻，放置15 min，以第1支試管為空白，在500 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程：y=9.621 8x+0.137，r=0.998 4。說明蘆丁在0.008～0.049 mg/mL內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取1.2 mL蘆丁對(duì)照品溶液，置10 mL帶塞試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)2.1.3小節(jié)操作，在500 nm處測(cè)定吸光度，平行測(cè)定6次，結(jié)果顯示：吸光度的SRSD為0.26%（n=6）。表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取0.2 mL供試品溶液，置10 mL帶塞試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)2.1.3小節(jié)操作，分別在0，30，60，90，120和150 min測(cè)定吸光度。結(jié)果顯示：吸光度的SRSD為2.14%（n=6）。表明供試品溶液在150 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

按照處方比例稱取適量各復(fù)方藥材，共6份，按照2.1.2小節(jié)中供試品溶液的制備方法制備，精密吸取0.2 mL，置10 mL的帶塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)2.1.3小節(jié)操作，在500 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算復(fù)方藥材中總黃酮含量。結(jié)果顯示：平均含量為13.05 mg/g（n=6），SRSD為1.85%（n=6）。說明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn)

按照處方比例稱取1/2量的重復(fù)性試驗(yàn)所使用的復(fù)方各藥材，共6份，再加入10.0 mg蘆丁對(duì)照品，按照2.1.2小節(jié)中供試品溶液的制備方法制備，再精密吸取0.2 mL供試品溶液，置10 mL的帶塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)2.1.3小節(jié)操作，在500 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.1.8 樣品測(cè)定

按照處方比例稱取適量各復(fù)方藥材，共3份，按照2.1.2小節(jié)中供試品溶液的制備方法制備，精密吸取0.2 mL，置10 mL的帶塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)2.1.3小節(jié)操作，在500 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算復(fù)方藥材中總黃酮含量。結(jié)果顯示，總黃酮含量為12.85，13.37和13.51 mg/g。

2.2 總黃酮的純化工藝研究

2.2.1 大孔樹脂的預(yù)處理[13]

將大孔樹脂用95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹后用水洗至無醇味，然后用5% HCl溶液浸泡2～3 h，用水洗至中性，再用5% NaOH溶液浸泡2～3 h，最后用水洗至中性，備用。

2.2.2 大孔樹脂的選擇

分別精密稱取已處理好的5種大孔樹脂，各1 g，置100 mL具塞三角瓶中，分別精密加入20 mL供試品溶液，室溫下放置吸附24 h，不時(shí)振搖，精密吸取1 mL上清液置10 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，搖勻。再精密吸取2 mL至10 mL具塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法制備，在500 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮的吸附率[14]。將吸附試驗(yàn)抽濾后的大孔樹脂放入100 mL具塞三角瓶中，加30 mL 60%乙醇進(jìn)行洗脫，室溫下放置解吸24 h，不時(shí)振搖，精密吸取1 mL上清液置10 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，再精密吸取2 mL置10 mL具塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法制備，在500 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮解析率[14]。結(jié)果見表2。通過分析，選擇DM301型大孔樹脂進(jìn)行純化。

表2 大孔樹脂篩選結(jié)果 單位：%

2.2.3 上樣濃度的考察

將5 g已處理好的DM301型大孔樹脂裝入色譜柱（內(nèi)徑為1.3 cm）中，共5份，分別加入質(zhì)量濃度為0.553，1.106，1.659，2.212和2.765 mg/mL的供試品溶液，各30 mL，以流速2 mL/min進(jìn)行吸附，之后用水洗至流出液無色，合并收集到的流出液，按2.1.3小節(jié)的方法進(jìn)行制備，測(cè)定吸光度，計(jì)算吸附率。結(jié)果見圖1。質(zhì)量濃度為2.212 mg/mL時(shí)，吸附率為60.89%，達(dá)到最大，故上樣質(zhì)量濃度選擇2.212 mg/mL。

圖1 上樣濃度的考察

2.2.4 上樣體積的考察

將5 g已處理好的DM301型大孔樹脂裝入色譜柱（內(nèi)徑為1.3 cm）中，加入供試品溶液（質(zhì)量濃度為2.212 mg/mL），以流速2 mL/min進(jìn)行吸附，收集流出液，每5 mL收集1份，按2.1.3小節(jié)的方法進(jìn)行制備，測(cè)定吸光度，計(jì)算流出液中總黃酮的泄漏量。結(jié)果見圖2?？傸S酮泄漏量隨著上樣體積的增加逐漸增多，當(dāng)上樣體積從25 mL增加至30 mL時(shí)，泄漏量從6.168 3 mg迅速上升至14.420 4 mg，樹脂達(dá)到飽和吸附，為了減少總黃酮的損失，故上樣體積選擇25 mL（質(zhì)量濃度為2.212 mg/mL）。

圖2 上樣體積的考察

2.2.5 上樣流速的考察

9、《關(guān)于進(jìn)一步落實(shí)重點(diǎn)群體創(chuàng)業(yè)就業(yè)稅收政策的通知》。11月23日，為支持和促進(jìn)重點(diǎn)群體創(chuàng)業(yè)就業(yè)，財(cái)政部、稅務(wù)總局、人力資源社會(huì)保障部財(cái)政部等三部門下發(fā)《關(guān)于進(jìn)一步落實(shí)重點(diǎn)群體創(chuàng)業(yè)就業(yè)稅收政策的通知》（財(cái)稅〔2018〕136號(hào)），就政策落實(shí)提出具體要求。

將5 g已處理好的DM301型大孔樹脂裝入色譜柱（內(nèi)徑為1.3 cm）中，共5份，分別加入25 mL供試品溶液（質(zhì)量濃度為2.212 mg/mL），以流速1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL/min進(jìn)行吸附，之后用水洗至流出液無色，合并收集到的流出液，按2.1.3小節(jié)的方法進(jìn)行制備，測(cè)定吸光度，計(jì)算吸附率。結(jié)果見圖3。流速為1.0 mL/min時(shí)總黃酮的吸附率最大，故選1.0 mL/min作為最佳上樣流速。

圖3 上樣流速的考察

2.2.6 洗脫溶劑的考察

將5 g已處理好的DM301型大孔樹脂裝入色譜柱（內(nèi)徑為1.3 cm）中，共5份，分別加入25 mL供試品溶液（質(zhì)量濃度為2.212 mg/mL），以流速1.0 mL/min進(jìn)行吸附，之后用水洗至流出液無色，再分別加入30 mL 20%，40%，60%，80%和95%乙醇，以流速2.0 mL/min進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，按2.1.3小節(jié)的方法進(jìn)行制備，測(cè)定吸光度，計(jì)算解吸率。結(jié)果見圖4。80%的乙醇洗脫時(shí)解吸率最大，因此選用80%乙醇作為洗脫劑。

圖4 洗脫溶劑的考察

2.2.7 洗脫流速的考察

將5 g已處理好的DM301型大孔樹脂裝入色譜柱（內(nèi)徑為1.3 cm）中，共5份，分別加入25 mL供試品溶液（質(zhì)量濃度為2.212 mg/mL），以流速1.0 mL/min進(jìn)行吸附，之后用水洗至流出液無色，再加入30 mL 80%乙醇，分別以流速1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL/min進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，按2.1.3小節(jié)的方法進(jìn)行制備，測(cè)定吸光度，計(jì)算解吸率。結(jié)果見圖5。流速在3 mL/min時(shí)，解吸率達(dá)到最大，因此選3 mL/min為最佳洗脫流速。

圖5 洗脫流速的考察

2.2.8 洗脫劑體積的考察

圖6 洗脫劑體積的考察

2.2.9 工藝驗(yàn)證

按照上述最佳純化工藝條件進(jìn)行裝柱、上樣、洗脫、收集洗脫液、回收乙醇、減壓干燥，即得純化后干膏。取適量供試品溶液（質(zhì)量濃度為2.212 mg/mL），濃縮，減壓干燥，即得純化前干膏。分別精密稱取適量純化前、后干膏，各3份，測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮含量。由結(jié)果可知：純化前干膏中總黃酮含量分別為5.20%，5.44%和5.78%，平均含量為5.47%（n=3）；純化后干膏中總黃酮含量分別為48.10%，53.28%和54.33%，平均含量為51.90%（n=3）。

2.3 總黃酮的抗氧化活性研究

2.3.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

精密稱取5 mg DPPH置100 mL棕色容量瓶中，加無水乙醇溶解，并定容至刻度，避光備用。分別精密吸取2 mL不同濃度的BHT乙醇溶液和純化前、后的樣品溶液（20，40，60，80和100 μg/mL），加2 mL DPPH溶液，混勻，放在暗處反應(yīng)30 min，在500 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算清除率。以2 mL水加2 mL DPPH溶液為控制樣本，BHT乙醇溶液為陽性對(duì)照，50%乙醇為空白。DPPH自由基清除率按式（1）計(jì)算[15]。

式中：A0為控制樣本的吸光度；As為測(cè)量樣本的吸光度。

清除DPPH自由基的能力用EC50表示，EC50越小，DPPH清除率越高，清除效果越好。由圖7可得，隨著總黃酮的濃度逐漸升高，消除率逐漸變大。BHT乙醇溶液清除DPPH自由基的能力EC50為80.57 μg/mL，沙棘異功方水提取物中總黃酮純化前的EC50為80.95 μg/mL，和BHT清除率基本相當(dāng)；純化后的EC50為52.91 μg/mL，說明明顯高于BHT清除率。

圖7 DPPH自由基清除能力測(cè)定

2.3.2 羥自由基清除能力測(cè)定

精密稱取0.150 1 g鄰二氮菲，置100 mL容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度；精密稱取0.204 7 g硫酸亞鐵，置100 mL容量瓶中，用水定容至刻度；精密吸取0.33 mL雙氧水，置10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，避光備用。分別精密吸取0.4 mL不同濃度的BHT乙醇溶液和純化前、后的樣品溶液（0.5，1.0，1.5，1.8和2.0 mg/mL），加2 mL PBS溶液、0.2 mL鄰二氮菲溶液、0.2 mL硫酸亞鐵溶液，混勻，于37 ℃水浴1 h，在536 nm處測(cè)定吸光度A樣；取2 mL PBS溶液、0.2 mL鄰二氮菲溶液、0.2 mL硫酸亞鐵溶液、4.6 mL水，于37 ℃水浴1 h，在536 nm處測(cè)定吸光度A空；取2 mL PBS溶液、0.2 mL鄰二氮菲溶液、0.2 mL硫酸亞鐵溶液、0.4 mL雙氧水溶液、4.2 mL水，于37 ℃水浴1 h，在536 nm處測(cè)定吸光度A損；取2 mL PBS溶液，5 mL水為校零。BHT乙醇溶液為陽性對(duì)照。羥自由基清除率按式（2）計(jì)算[16]。

式中：A樣為樣品的吸光度；A空為空白的吸光度；A損為損傷的吸光度。

清除羥基自由基的能力用EC50表示，EC50越小，羥基自由基清除率越高，清除效果越好。由圖8可得，隨著總黃酮的濃度逐漸升高，消除率逐漸變大。BHT乙醇溶液清除羥基自由基的能力EC50為1.29 mg/mL，沙棘異功方水提取物中總黃酮純化前清除羥基自由基的能力EC50為2.04 mg/mL，明顯低于BHT清除率；純化后的EC50為1.51 mg/mL，略低于BHT清除率。

圖8 羥基自由基清除能力測(cè)定

3 結(jié)論與討論

在預(yù)試驗(yàn)中比較了大孔樹脂和聚酰胺對(duì)沙棘異功方水提取物中總黃酮的分離純化效果，結(jié)果采用大孔樹脂純化后的總黃酮含量較高，故選用大孔樹脂作為吸附劑。之后對(duì)不同型號(hào)的大孔樹脂（D101、HNK-9、AB-8、DM301、HPD600）的分離純化能力進(jìn)行了比較分析，最終選擇DM301型作為試驗(yàn)樹脂。通過動(dòng)態(tài)吸附和解吸附影響因素的考察，得出大孔樹脂純化沙棘異功方水提取物中總黃酮的最佳純化工藝：上樣體積為25 mL（質(zhì)量濃度為2.212 mg/mL），上樣流速為1 mL/min，用80%的乙醇50 mL進(jìn)行洗脫，洗脫流速為3 mL/min。純化前總黃酮含量為5.47%，純化后總黃酮的含量為51.90%，純度提高了9.49倍。

文章還比較分析了沙棘異功方水提取物中總黃酮在大孔樹脂純化前后的抗氧化能力，結(jié)果顯示：總黃酮純化前清除DPPH自由基的能力EC50為80.95 μg/mL，純化后的EC50為52.91 μg/mL；總黃酮純化前清除羥基自由基的能力EC50為2.04 mg/mL，純化后的EC50為1.51 mg/mL。說明純化后沙棘異功方水提取物中總黃酮在純度提升的同時(shí)，抗氧化能力也有所增強(qiáng)，說明DM301型大孔樹脂能夠用于分離純化沙棘異功方水提取物中的總黃酮。