標(biāo)準(zhǔn)加入法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定松茸中總砷含量的比較

黃智安，沈蕊，羅欣，余進(jìn)，田浩，陳彥和

勁牌有限公司，中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（黃石 435100）

松茸（Tricholoma matsutake），又名松口蘑，隸屬擔(dān)子菌門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes）傘菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae）口蘑屬（Tricholoma），是松、櫟等樹(shù)木外生的菌根真菌[1]。松茸是一種珍稀名貴的野生食用菌，營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、維生素及多種礦物質(zhì)元素，味道鮮美，位于中國(guó)四大名菌之首，有菌中之王的美譽(yù)。在我國(guó)主要分布在吉林、四川、云南、西藏等地，安徽、廣西等地有少量分布。研究表明，松茸具有抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、促腸胃、預(yù)防糖尿病、抗運(yùn)動(dòng)疲勞等保健功能[2]。也有研究表明，食用菌類對(duì)重金屬具有較強(qiáng)富集能力[3]。段志敏等[4]測(cè)定云南省昆明、楚雄、大理、玉溪4個(gè)地區(qū)7份松茸樣品的總砷含量，結(jié)果表明超標(biāo)率為100%。

松茸及其制品污染物限量一直是市場(chǎng)爭(zhēng)議的焦點(diǎn)，其中GB 2762—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》中規(guī)定的總砷限量為0.5 mg/kg，而四川省、云南省地方標(biāo)準(zhǔn)DBS 51/006—2018《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 松茸及其制品》和DBS 53/022—2016《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 松茸及其制品》中規(guī)定的無(wú)機(jī)砷限量為1.0 mg/kg[5-7]。食品中的砷以無(wú)機(jī)態(tài)砷和有機(jī)態(tài)砷2種形態(tài)存在，無(wú)機(jī)態(tài)砷毒性較大。松茸中砷含量很高且含有不同的砷形態(tài)，包括砷甜菜堿、砷膽堿、3價(jià)砷、5價(jià)砷、一甲基砷、二甲基砷、三甲基氧化砷和砷糖[8]。

測(cè)定總砷的方法有原子吸收光譜法（AAS）、原子熒光光譜法（AFS）、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP-OES）、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICPMS）等[9]。測(cè)定無(wú)機(jī)砷的方法有液相色譜-原子熒光光譜法[10]、液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法[11]，馬偉等[12]采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法、原子熒光光譜法、液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法3種方法測(cè)定松茸中總砷及無(wú)機(jī)砷含量。結(jié)果表明，凍干松茸粉中砷主要以有機(jī)態(tài)存在，且不同檢測(cè)方法以及前處理方式都會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。在使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法時(shí)，最易出現(xiàn)的問(wèn)題是來(lái)自基體的干擾。因此，針對(duì)樣品基質(zhì)較復(fù)雜，基體效應(yīng)影響較大或無(wú)法確證時(shí)，應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)加入法。

標(biāo)準(zhǔn)加入法，又名標(biāo)準(zhǔn)增量法或直線外推法，是一種被廣泛應(yīng)用于分析復(fù)雜基體樣品的方法。作為檢驗(yàn)準(zhǔn)確度的測(cè)試方法，能有效避免樣品基質(zhì)的干擾，且試驗(yàn)誤差較小，穩(wěn)定性更高[13]。當(dāng)很難配置與樣品溶液相似的標(biāo)準(zhǔn)溶液，或樣品基體成分很高，且變化不定，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法非常有效。具體操作方法：將不同梯度的一定量已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入待測(cè)樣品中，采用相同的前處理方法，保持一致上機(jī)測(cè)試。橫坐標(biāo)為不同梯度的已知濃度值，縱坐標(biāo)為響應(yīng)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線與橫坐標(biāo)的交點(diǎn)即為樣品的濃度。

試驗(yàn)采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)松茸中總砷測(cè)定的準(zhǔn)確性進(jìn)行比較研究，為此類復(fù)雜基體中總砷的測(cè)試分析提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器與設(shè)備

iCAP RQ型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）；PRO型微波消解儀（奧地利安東帕有限公司）；ELGA型純水機(jī)（英國(guó)威立雅公司）；SQP型分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；DFT-50A粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；101-2AB電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.1.2 材料與試劑

硝酸；砷單元素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心）；鋰、鈧、鍺、釔、銠、銦、鉍混合元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心）。除另有說(shuō)明，所用試劑均為優(yōu)級(jí)純，水為GB/T 6682—2016《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定的一級(jí)水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密量取適量砷單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用硝酸溶液（5+95）稀釋制成每1 mL含砷為100 μg的溶液，即得砷標(biāo)準(zhǔn)貯備液1；精密量取適量砷標(biāo)準(zhǔn)貯備液1，用硝酸溶液（5+95）稀釋制成每1 mL別含砷為1 μg溶液，即得砷元素標(biāo)準(zhǔn)貯備液2。精密量取適量砷標(biāo)準(zhǔn)貯備液2，用硝酸溶液（5+95）稀釋制成每1 mL含砷0，1.00，5.00，10.0，30.0和50.0 ng的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 內(nèi)標(biāo)溶液的制備

精密量取適量鋰、鈧、鍺、釔、銠、銦、鉍混合元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水稀釋制成每1 mL各含100 ng的混合溶液。

1.4 供試品溶液的制備

樣品精密稱取，置耐壓耐高溫微波消解罐中，加5 mL硝酸。密閉并按微波消解儀的相應(yīng)要求及一定的消解程序進(jìn)行消解。待冷卻后取出，緩慢打開(kāi)消解罐蓋排氣，用少量水沖洗內(nèi)蓋，將消解罐放在控溫電熱板上加熱30 min，用水定容至50 mL容量瓶中，搖勻備用，同時(shí)做空白試驗(yàn)。

標(biāo)準(zhǔn)加入法供試品溶液的制備：分別精密稱取同質(zhì)量的5份樣品，依次加入不同濃度的砷標(biāo)準(zhǔn)溶液，置耐壓耐高溫微波消解罐中，加硝酸5 mL。密閉并按微波消解儀的相應(yīng)要求及一定的消解程序進(jìn)行消解。待冷卻后取出，緩慢打開(kāi)消解罐蓋排氣，用少量水沖洗內(nèi)蓋，將消解罐放在控溫電熱板上加熱30 min，用水定容至50 mL容量瓶中，搖勻備用。

1.5 儀器條件

使用調(diào)諧液調(diào)整儀器各項(xiàng)指標(biāo)，使儀器靈敏度、氧化物、雙電荷、分辨率等各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到測(cè)定要求。儀器RF功率1 550 W，采樣深度5 mm，冷卻氣流速14.0 L/min，霧化氣流速1.11 L/min，輔助氣流速0.80 L/min，CCT碰撞氣流速4.17 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性與檢出限、定量限

標(biāo)準(zhǔn)曲線法：以砷0，1.00，5.00，10.0，30.0和50.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)加入法：樣品中加入的砷標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度分別是0，5.00，10.0，15.0和20.0 ng/mL。

測(cè)定時(shí)選取的同位素為75As，內(nèi)標(biāo)元素校正選擇內(nèi)插模式。依次將儀器的樣品管插入各個(gè)濃度溶液中進(jìn)行測(cè)定，以測(cè)量值（3次讀數(shù)的平均值）為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。

表1 線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

試驗(yàn)表明，75As能被檢測(cè)，專屬性較好，且元素的強(qiáng)度響應(yīng)值與其濃度之間均具有良好的線性關(guān)系。

通過(guò)連續(xù)進(jìn)行空白溶液的重復(fù)測(cè)試，檢出限（LOD）按照3倍空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率來(lái)計(jì)算，而定量限LOQ按照10倍空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率來(lái)計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2看出，標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法砷的檢出限分別為0.053和0.037 ng/mL，而定量限分別為0.176和0.123 ng/mL。以稱取0.5 g樣品，定容至50 mL計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法砷的檢出限分別為0.005 3和0.003 7 mg/kg。

表2 檢出限與定量限 單位：ng/mL

2.2 檢測(cè)方法的比較

為比較標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法這2種檢測(cè)方法對(duì)測(cè)定松茸中總砷的差異性，采用微波消解法進(jìn)行前處理，標(biāo)準(zhǔn)曲線法以六平行試驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)加入法以三平行試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線法與標(biāo)準(zhǔn)加入法比較

結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定松茸樣品中總砷含量，2種方法測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差SRSD均小于5%。

2.3 精密度與準(zhǔn)確度

選擇有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)紫菜GBW 10023，分別取6份平行樣，按照前處理方法處理，精密度采用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）表示，2種方法總砷的測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定值與標(biāo)準(zhǔn)值比較

結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)試的總砷結(jié)果均在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差SRSD為1.6%，標(biāo)準(zhǔn)加入法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差SRSD為1.4%，而標(biāo)準(zhǔn)加入法總砷的平均值更接近標(biāo)準(zhǔn)值的中位值。說(shuō)明2種方法的精密度與準(zhǔn)確度均較高，而標(biāo)準(zhǔn)加入法更適合一些基體較復(fù)雜樣品的測(cè)試。

2.4 干擾驗(yàn)證試驗(yàn)

ICP-MS測(cè)定的干擾大致可分為物理干擾和質(zhì)譜干擾。物理干擾可采用內(nèi)標(biāo)法校正或者基體匹配消除，質(zhì)譜干擾可以通過(guò)干擾方程校正或者碰撞/反應(yīng)池模式去除[14]。ICP-MS分析75As時(shí)會(huì)受到多種干擾，如雙電荷離子150Sm++和150Nd++、多原子離子40Ar35Cl+和40Ca35Cl+等[15-16]。選擇雙電荷離子150Sm++和150Nd++對(duì)測(cè)定砷的干擾進(jìn)行驗(yàn)證，通過(guò)儀器調(diào)諧使得雙電荷離子產(chǎn)率在3%以下。測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 儀器調(diào)諧

分別配制質(zhì)量濃度1，10和100 ng/mL系列的含釹和釤混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用砷的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定溶液中含有的砷含量，即計(jì)算釤（釹）干擾產(chǎn)生的砷濃度。同時(shí)，在松茸供試品溶液中分別加入質(zhì)量濃度2和20 ng/mL系列的含釹和釤混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用砷的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定溶液中含有的砷含量，比較含釹和釤混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入前后之間的差別。

表6 干擾產(chǎn)生的砷質(zhì)量濃度 單位：ng/mL

松茸供試品溶液中Sm、Nd的含量均較低，在松茸供試品溶液分別加入2和20 ng/mL的Sm、Nd混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，與加入之前的結(jié)果無(wú)顯著差異，因此，松茸中較低含量的Sm、Nd所產(chǎn)生的雙電荷離子150Sm++、150Nd++對(duì)砷的測(cè)定無(wú)干擾。

表7 松茸中總砷含量

3 結(jié)論

采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測(cè)定松茸中總砷的含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法的線性均良好，相關(guān)系數(shù)R2均在0.999 0以上，砷的檢出限分別為0.053和0.037 ng/mL，定量限分別為0.176和0.123 ng/mL。以稱取0.5 g樣品，定容至50 mL計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法砷的檢出限分別為0.005 3和0.003 7 mg/kg。

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定松茸樣品中總砷含量的比較，2種方法測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差SRSD均小于5%。以有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)紫菜GBW 10023進(jìn)行精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)試的總砷結(jié)果均在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)，而標(biāo)準(zhǔn)加入法總砷的平均值更接近標(biāo)準(zhǔn)值的中位值。說(shuō)明2種方法的精密度與準(zhǔn)確度均較高，而標(biāo)準(zhǔn)加入法更適合一些基體較復(fù)雜樣品的測(cè)試。

同時(shí)，對(duì)測(cè)定過(guò)程的干擾因素進(jìn)行驗(yàn)證，松茸中較低含量的Sm、Nd所產(chǎn)生的雙電荷離子150Sm++、150Nd++對(duì)砷的測(cè)定無(wú)干擾。因此，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測(cè)定松茸中總砷的方法準(zhǔn)確、可靠。標(biāo)準(zhǔn)加入法作為標(biāo)準(zhǔn)曲線法的補(bǔ)充，可有效分析這類復(fù)雜基體樣品測(cè)定的準(zhǔn)確性。