高效液相色譜法快速測定白酒中紐甜的含量

許文雅，張宏宏，林洋，劉瀛，郁蕉竹，鞠曉瑩

沈陽市食品藥品檢驗所（沈陽 110122）

紐甜是一種合成甜味劑，其甜味純正，口味較接近蔗糖，但其甜度高，甜度是蔗糖的8 000～13 000倍，且無能量[1-3]，紐甜在體內(nèi)代謝后的產(chǎn)物能較快排出體外。紐甜穩(wěn)定性好、安全性高，因此被廣泛應(yīng)用在食品行業(yè)中[4-5]。

白酒是通過糧食發(fā)酵等一系列工藝釀造的蒸餾酒，經(jīng)過時間的發(fā)酵和精良的工藝，使酒中含有豐富的多元醇或酮等甜味物質(zhì)，這些物質(zhì)使白酒的口感更香醇。但有些酒類生產(chǎn)企業(yè)為了降低生產(chǎn)成本、改善白酒的口感，在生產(chǎn)過程中添加甜味劑，這種違規(guī)添加行為影響了酒類行業(yè)發(fā)展的食品安全問題[6-7]。依據(jù)GB 2760—2014[8]《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定，發(fā)酵酒中不得添加甜味劑，白酒中不允許添加紐甜。

關(guān)于白酒中紐甜的檢測方法國內(nèi)外已有大量報道，主要檢測方法有高效液相色譜法[9-14]、液相質(zhì)譜法[15-18]等，但液相質(zhì)譜法運(yùn)營成本相對較高。目前，高效液相色譜法應(yīng)用較多，其中GB 5009.247—2016[19]《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中紐甜的測定》應(yīng)用較多，該方法是樣品經(jīng)過混合提取液提取、C18固相萃取柱凈化、氮吹濃縮等前處理步驟，處理過程較為復(fù)雜，影響因素多，導(dǎo)致回收率低。因此試驗在國標(biāo)法基礎(chǔ)上，優(yōu)化白酒中紐甜的前處理過程和高效液相色譜條件，為測定白酒中紐甜的含量提供一種簡單快速、精密度高、回收率好、成本低的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紐甜標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 mg/L，北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限公司）；乙腈（色譜純，美國Sigma公司）；乙酸銨（色譜純，fisher chemical）；辛烷磺酸鈉（色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸二氫鉀（優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；超純水（電導(dǎo)率：18.2 MΩ.cm，25 ℃，自制）；水系濾膜（0.45 μm，上海安譜實(shí)驗科技股份有限公司）。

30個不同廠家白酒樣品：市場購買。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀（配2998PDA檢測器，美國Waters公司）；BSA224S-CW分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；Quintix213-1CN電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；KQ-250DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；H1750R高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；Milli-Q reference超純水機(jī)（Millipore SAS公司）；705878（20-200 μL）/705880（100-1 000 μL）移液器（普蘭德公司）；NZ44739（5-50 μL）移液器（賽默飛世爾科技公司）。

1.3 試驗條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Thermo C18柱，4.6 mm×150 mm，5 μm；流動相：乙腈-辛烷磺酸鈉溶液40∶60（V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：50 μL；波長：210 nm。

1.3.2 樣品的前處理條件

精確稱取5 mL白酒于10 mL玻璃刻度管中，于氮吹儀中除去乙醇，取出后用水定容至刻度，充分混勻，濾液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，供高效液相色譜檢測。

1.3.3 溶液的配制

辛烷磺酸鈉溶液：稱取2.00 g辛烷磺酸鈉用水溶解，加1 mL磷酸，加水定容至1 000 mL。

100 mg/L紐甜儲備液：準(zhǔn)確量取1.0 mL紐甜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液：分別準(zhǔn)確移取100 mg/L的紐甜儲備液0.02，0.05，0.1，0.5和1.0 mL于10 mL容量瓶中，加水定容到刻度，輕搖混勻，標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液中紐甜的質(zhì)量濃度分別為0.2，0.5，1.0，5.0和10 mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件的選擇與比較

國標(biāo)方法采用甲酸和三乙胺混合提取液提取、超聲，通過固相萃取柱凈化，氮吹后再用甲醇洗脫，處理過程繁瑣，易導(dǎo)致樣品中的紐甜損失大，回收率偏低，且固相萃取柱的成本高。白酒基質(zhì)較為純凈，有研究表明紐甜在水溶液中穩(wěn)定性好[20]，但白酒樣品中含有乙醇，在低波長下直接進(jìn)樣容易出現(xiàn)干擾峰，因此試驗中先揮發(fā)掉乙醇，再用水定容至原體積。在相同的色譜條件下進(jìn)樣分析，圖1是紐甜標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖，圖2是白酒樣品直接進(jìn)樣溶液色譜圖，圖3是白酒除去乙醇后溶液色譜圖，圖2和圖3對比可以看出，直接進(jìn)樣后得到的色譜圖雜質(zhì)峰多，特別是在紐甜出峰位置附近有干擾峰，若保留時間稍有偏移，就會造成目標(biāo)峰識別錯誤，造成紐甜含量變化，導(dǎo)致定量結(jié)果不準(zhǔn)確。相對于直接進(jìn)樣來說，除去乙醇后色譜圖中紐甜出峰位置附近的干擾峰較少，從而提高了目標(biāo)峰識別的正確率，保證了定量的準(zhǔn)確性。通過直接進(jìn)樣和除去乙醇兩種方式比較，首先確定了除去乙醇后再進(jìn)樣的前處理方式。

圖1 紐甜標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 白酒樣品直接進(jìn)樣溶液色譜圖

圖3 白酒樣品除乙醇后溶液色譜圖

國標(biāo)方法采用甲酸和三乙胺混合提取液提取、超聲，通過固相萃取柱凈化，氮吹后再用甲醇洗脫，處理過程繁瑣，易導(dǎo)致樣品中的紐甜損失大，回收率偏低，且固相萃取柱的成本高。此方法通過取白酒試樣先氮吹除去乙醇，再用水定容后直接上機(jī)檢測，盡可能做到無損失。對國標(biāo)方法和本方法分別進(jìn)行加標(biāo)試驗，平行測定3次，測得紐甜的回收率，得到的試驗結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，白酒除去乙醇后，用水定容后上機(jī)得到的紐甜回收率高。圖4是白酒除乙醇后加標(biāo)溶液色譜圖。

表1 兩種前處理方法回收率比較 單位：%

圖4 白酒除乙醇后加標(biāo)溶液色譜圖

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動相及洗脫條件的選擇

試驗選取了甲醇-辛烷磺酸鈉溶液、乙腈-磷酸二氫鉀溶液、乙腈-乙酸銨溶液作為流動相進(jìn)行分析。通過試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用甲醇-辛烷磺酸鈉溶液為流動相，紐甜的峰形不好，乙腈-辛烷磺酸鈉溶液、乙腈-磷酸二氫鉀溶液、乙腈-乙酸銨溶液為流動相時，紐甜峰形對稱性較好，均能有效地分離雜質(zhì)，但乙腈-磷酸二氫鉀溶液、乙腈-乙酸銨溶液作為流動相時，樣品中的雜質(zhì)峰較大，基線不如乙腈-辛烷磺酸鈉體系平穩(wěn)，因此選擇乙腈-辛烷磺酸鈉溶液為流動相。國標(biāo)中流動相的洗脫方式是梯度洗脫，在梯度洗脫過程中可能會出現(xiàn)基線漂移的情況，且耗時較長，由于白酒的成分比較簡單，等度洗脫也能夠較好地分離紐甜，對梯度洗脫方式和等度洗脫方式分別進(jìn)行了考察，試驗結(jié)果表明，兩種洗脫方式無明顯差異，所以試驗采用乙腈-辛烷磺酸鈉溶液等度洗脫的方式。乙腈-辛烷磺酸鈉溶液比例為（40∶60）洗脫時，紐甜與樣品中的雜質(zhì)分離良好，出峰時間快。

色譜柱選用了Thermo C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5.0 μm）進(jìn)行色譜分離，國標(biāo)中使用C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm），兩種色譜柱所分離出的目標(biāo)化合物的峰形，分離度都滿足要求，考慮250 mm色譜柱的出峰時間更長，成本更高，所以采用150 mm色譜柱，紐甜標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1。

2.2.2 檢測波長的選擇

利用二極管陣列檢測器（PDA）對紐甜標(biāo)準(zhǔn)品溶液在波長190～400 nm范圍內(nèi)掃描，光譜圖顯示，紐甜在200～218 nm范圍內(nèi)都有吸收，隨著波長增加，吸收值逐漸下降，但考慮到乙腈在210 nm以下有紫外末端吸收，因此選擇檢測波長為210 nm。

2.3 在優(yōu)化條件下進(jìn)行方法驗證及白酒中紐甜的檢測

2.3.1 線性范圍

分別取0.2，0.5，1.0，5.0和10 mg/L的紐甜標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為Y=38 814X-825，相關(guān)系數(shù)為0.999 978，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5。結(jié)果表明紐甜在0.2～10 mg/L線性關(guān)系良好。

圖5 紐甜標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3.2 檢出限和定量限

以3倍信噪比（rSN）測得紐甜檢出限為0.06 mg/kg，以10倍信噪比（rSN）測得紐甜定量限為0.2 mg/kg，表明該色譜條件具有較高的檢測靈敏度，能準(zhǔn)確進(jìn)行定量，滿足GB 5009.247—2016[19]的要求。

2.3.3 加標(biāo)回收率和精密度

選取白酒空白基質(zhì)樣品，分別加入一定量的紐甜標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中紐甜的添加量分別為0.2，0.5和1.0 mg/kg，每個質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平分別做6組平行試樣，按上述前處理條件和色譜條件測定樣品中的紐甜含量，并計算其加標(biāo)回收率和精密度，結(jié)果見表2。由表2可知，紐甜加標(biāo)平均回收率為97.1%～99.0%，三個不同水平下的精密度分別為1.3%，1.1%和0.39%，滿足GB/T 27404—2008[21]《實(shí)驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》要求，說明方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

表2 回收率試驗結(jié)果

2.4 實(shí)際樣品的檢測

從市場上抽取30個不同廠家的白酒樣品，按上述優(yōu)化后的處理方法進(jìn)行紐甜的快速檢測，結(jié)果表明，29份樣品中未檢出紐甜，1份樣品中有紐甜檢出，含量為0.810 mg/kg，紐甜的出峰時間穩(wěn)定，分離度良好。表明白酒市場存在非法添加甜味劑的現(xiàn)象，相關(guān)部門應(yīng)對此現(xiàn)象進(jìn)行關(guān)注。陽性樣品色譜圖見圖6。

圖6 陽性樣品色譜圖

3 結(jié)論

建立了快速測定白酒中紐甜含量的高效液相色譜法，在GB 5009.247—2016[19]《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中紐甜的測定》的基礎(chǔ)上，簡化了紐甜檢測的前處理方法，優(yōu)化了液相條件，將其用于對白酒中紐甜含量的檢測。以乙腈-辛烷磺酸鈉溶液（40∶60，V/V）為流動相，檢測波長210 nm，能夠獲得良好的響應(yīng)和分離度。在白酒的前處理過程中，樣品利用氮吹儀除乙醇后用水定容，操作簡單。試驗結(jié)果表明：紐甜在0.2～10 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系，靈敏度高，方法檢出限為0.06 mg/kg，定量限為0.2 mg/kg；準(zhǔn)確度高，3個不同添加量水平下紐甜平均加標(biāo)回收率為97.1%～99.0%；重復(fù)性好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）為0.39%～1.3%。相較于國標(biāo)方法復(fù)雜的前處理過程以及回收率不穩(wěn)定的情況，該方法前處理簡單快速，檢測時間短，方法準(zhǔn)確度高，精密度好，檢測成本低，可快速有效地測定白酒中的紐甜，滿足日常檢測的要求，為檢測白酒中的紐甜提供了一種經(jīng)濟(jì)快速的方法。