兩種2-苯基吡啶銥配合物的合成及其在細胞中的應用

王亞軒, 于 坤, 沈舒婷, 王 慧

(皖南醫學院 藥學院,安徽 蕪湖 241002)

熒光金屬配合物因兼具有機化合物熒光量子產率高和無機化合物光熱穩定性好的優勢,被認為是最具有發展和應用前景的一類發光材料[1-2]。常見的熒光金屬配合物主要包括具有d10電子構型的Zn(II)[3]、 Cu(II)[4], d6電子構型的Ru(II)[5]、 Ir(III)[6]、 Os(II)[7]和d8電子構型的Pt(II)[8]等。與其它金屬配合物相比,銥配合物優勢突出,如可調控的吸收和發射波段、較高熒光量子產率、較好耐光性以及較長磷光壽命等,在有機電致發光、離子/分子檢測、有機發光二極管、生物成像以及疾病早期診斷等領域受到廣泛關注[9-11]。因此開發新型金屬銥配合物并研究其在生物化學領域的應用具有重要意義。

基于此,本文以常見的C^N配體2-苯基吡啶(ppy)為母體,選擇鄰菲羅啉衍生物作為輔助配體,引入不同的末端基團,設計并合成了兩種銥配合物IrL1和IrL2(圖1),其結構經核磁共振氫譜、碳譜、質譜和傅里葉紅外光譜表征。研究了兩種配合物在不同溶劑中的紫外可見吸收光譜和熒光發射光譜,并采用MTT實驗和共聚焦顯微成像技術研究了配合物IrL1和IrL2在HepG2細胞中的應用效果。

圖1 配合物IrL1和IrL2的合成路線

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker Avance (400/600 Hz)型核磁共振儀(TMS為內標);AB SCIEX MALDI-TOF型基質輔助激光解析飛行時間質譜儀;Nicolet FTIR is5型傅里葉變換紅外光譜儀(溴化鉀壓片);UV-5900 PC型紫外可見分光光度計;HITACHI F-4600型熒光分光光度計;Infinite 200 Pro型多功能酶標儀;Leica TCS SP8型共聚焦顯微鏡。

IrCl3·3H2O, 4-(2-吡啶基)-苯甲醛(>95%),鄰菲啰啉(99%),對羥基苯甲醛(98%),香草醛(99%),溴丁烷(99%),上海阿拉丁試劑公司;其余試劑為分析純,上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 合成

(1) 配體L1的合成

在250 mL三口燒瓶中依次加入鄰菲羅啉雙酮[12](0.74 g, 3.50 mmol),中間體M1[13](0.62 g, 3.50 mmol),乙酸銨(5.75 g, 75.00 mmol)和75 mL冰乙酸,氮氣保護下,于120 ℃反應4 h。冷卻至室溫,倒入大量冰水中,用NaOH溶液調pH至7,析出固體,減壓抽濾,所得濾餅用甲醇重結晶得淡褐色固體L10.35 g;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.98(d,J=4.0 Hz, 2H), 8.87(d,J=8.0 Hz, 2H), 8.18(d,J=8.5 Hz, 2H), 7.79～7.77(m, 2H), 7.11(d,J=8.4 Hz, 2H), 4.02(t,J=6.4 Hz, 2H), 1.74～1.66(m, 2H), 1.49～1.38(m, 2H), 0.91(t,J=7.4 Hz, 3H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 160.31, 151.24, 148.02, 143.86, 129.94, 128.22, 123.63, 122.93, 115.28, 67.80, 31.17, 19.17, 14.14。

(2) 配合物IrL1的合成

(3) 配體L2的合成

合成方法與配體L1類似,最終得褐色固體0.29 g;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.96～8.92(m, 4H), 7.90(s, 1H), 7.85(d,J=8.3 Hz, 1H), 7.77～7.75(m, 2H), 7.11(d,J=8.3 Hz, 1H), 4.01(t,J=6.5 Hz, 2H), 3.89(s, 3H), 1.74～1.67(m, 2H), 1.47～1.40(m, 2H), 0.93(t,J=7.4 Hz, 3H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 152.28, 149.71, 149.49, 147.70, 143.65, 140.93, 140.89, 130.13, 123.99, 123.53, 119.67, 113.31, 110.44, 68.36, 56.13, 31.27, 19.21, 14.16。

(4) 配合物IrL2的合成

1.3 配合物的光學性質測試方法

將配合物IrL1和IrL2分別配成濃度為1.0 mmol·L-1的母液(溶劑為二甲基亞砜)。移取50 μL母液,分別加入5 mL容量瓶中,定容至配合物終濃度為10 μM。溶劑分別為1,4-二氧六環(DOA)、乙酸乙酯(EA)、四氫呋喃(THF)、乙醇(EtOH)、乙腈(CH3CN)、二甲基亞砜(DMSO)和PBS緩沖溶液(pH=7.40)。熒光光譜的實驗參數設置為激發波長410 nm,狹縫寬度10 nm,電壓500 V。

1.4 細胞毒性和細胞成像測試方法

細胞毒性實驗、細胞傳代和培養方法參照文獻[15]。當細胞密度達到實驗要求時,設置如下兩組實驗:(1) 10 μM配合物IrL1和IrL2分別與HepG2活細胞共培養30 min; (2)用4%多聚甲醛固定細胞15 min,移去多聚甲醛,PBS洗滌兩次,分別加入10 μM配合物IrL1和IrL2的DMEM溶液,與固定細胞共培養30 min。所有細胞用PBS洗滌兩次后,直接用于共聚焦成像。

2 結果與討論

2.1 合成與表征分析

以鄰菲羅啉、對羥基苯甲醛、香草醛和溴丁烷為原料,通過親核取代反應和縮合反應等,在氮氣保護下簡潔高效地合成了兩種有機配體L1和L2,然后與銥二氯橋化合物中間體M3在氮氣保護和避光條件下進行配位反應,經過柱層析分離提純,得到了兩種陽離子型銥配合物IrL1和IrL2。

2.2 光物理性質分析

測試了配合物IrL1和IrL2在7種不同極性的常見溶劑中的紫外可見吸收光譜和熒光發射光譜,比較并分析兩種配合物的光學性質。圖2為兩種配合物在不同溶劑中的紫外可見吸收光譜,從圖2中可看出,配合物IrL1和IrL2在300 nm均有1個較強的吸收峰,摩爾吸收系數均大于1.0×104,可能源于配體內自旋允許的π-π*躍遷過程。在370～450 nm內出現1個中等強度的吸收峰,可能是由于自旋允許的金屬到配體之間的電荷轉移躍遷(MLCT)[16]。配合物IrL1和IrL2的紫外可見吸收光譜未隨著溶劑極性的增加發生明顯變化(除了PBS以外)。

圖3為配合物IrL1和IrL2在不同溶劑中的熒光發射光譜。配合物IrL1和IrL2在乙醇中的熒光強度高于在其它溶劑中,在乙醇中配合物的激發態相比于在其它溶劑中更加穩定。這兩種配合物在DOA、 CH3CN和DMSO溶劑中表現出明顯的精細結構,表明其發射激發態除了具有MLCT特征外,還具有明顯的3LC特征[17]。與配合物IrL2相比,配合物IrL1的熒光強度更高,但最大發射峰位置未發生明顯改變,說明在配合物IrL2中引入甲氧基對整個配合物共軛程度的增加沒有明顯貢獻。

λ/nm

2.3 細胞毒性分析

選取HepG2細胞為研究對象,采用MTT法評價配合物IrL1和IrL2與細胞共培養24 h后的細胞存活率。由圖4可知,即使配合物濃度到30 μM時,細胞的存活率仍在80%以上,說明配合物IrL1和IrL2具有較低的細胞毒性,可將其用于后續的細胞成像研究。

c/μM

2.4 細胞成像分析

圖5是配合物IrL1和IrL2在活細胞和固定細胞中的細胞成像圖。由圖5可知,兩種配合物只在固定的HepG2細胞的細胞質中展現出明顯的熒光信號,而在HepG2活細胞的細胞質中的熒光信號較弱。造成這種現象的原因可能是由于細胞被固定后,膜的通透性發生改變,更有利于配合物穿過細胞膜進入到細胞質。

圖5 配合物IrL1或IrL2與HepG2活細胞和固定細胞共培養30 min后的共聚焦成像圖

本文以2-苯基吡啶為母體,鄰菲羅啉為輔助配體,合成了兩種銥配合物IrL1和IrL2,系統研究了這兩種配合物在不同極性溶劑中的光物理性質。生物學研究結果表明:配合物IrL1和IrL2細胞毒性低,可定位于固定細胞的細胞質中。此實驗結果為后期設計合成以2-苯基吡啶為母體的銥配合物提供了實驗依據。