組織蛋白酶S對氧化型低密度脂蛋白誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷和內皮間質轉化的影響和機制研究

葛曙雄 王 輝 許中友 （寧波大學附屬人民醫院血管外科，寧波 315000）

近年來，隨著生活方式和飲食習慣的改變，由動脈粥樣硬化引起的心腦血管疾病的發病率和病死率在逐年升高，成為了全球人口死亡的主要原因［1］。內皮細胞功能障礙被認為是動脈粥樣硬化發生的起始環節，它主要是由氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）引起的［2］。ox-LDL可破壞血管內皮細胞的氧化還原平衡，誘導內皮細胞凋亡［3］。此外，動脈粥樣硬化損傷內皮后，會改變內皮細胞表型，使其獲得間質細胞表型，稱為內皮間質轉化（endothelial-mesenchymal transition，EndMT）［4］。最近越來越多的研究顯示EndMT在動脈粥樣硬化的發生和發展過程中具有重要作用［4-5］。組織蛋白酶S（cathepsin S，CTSS）是一個能夠促進炎癥性疾病的溶酶體蛋白酶，研究發現CTSS可調控內皮細胞的功能，如下調CTSS可引起缺氧誘導的內皮細胞侵襲、增殖和管腔形成受損，造成血管生成能力減弱，這與過氧化物酶體增殖物激活受體γ和血管內皮生長因子表達水平減少以及Akt、ERK1/2、p38 MAPK通路被抑制有關［6］。CTSS還可通過蛋白酶激活受體2選擇性地破壞腎小球內皮細胞的完整性和屏障功能［7］。文獻顯示CTSS在動脈粥樣硬化組織和血清中高表達，具有高水平CTSS的患者頸動脈內中膜厚度越厚，血糖和血脂水平較高，但是一氧化氮水平較低［8-9］。在LDL受體缺陷型小鼠中敲除CTSS明顯降低了斑塊面積和內膜厚度以及脂質積累［10］。這些研究提示CTSS可能與動脈粥樣硬化中內皮損傷有一定聯系。但是目前CTSS對動脈硬化過程中內皮細胞損傷的作用及可能的機制尚未見相關報道。因此，本研究使用ox-LDL刺激人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vascular endothelial cells，HUVECs）模擬內皮細胞損傷，通過siRNA干擾技術下調CTSS，探究CTSS對內皮細胞損傷和EndMT的影響和機制。

1 材料與方法

1.1 材料 HUVECs細胞為美國ATCC產品；DMEM高糖培養基為美國Hyclone公司產品；胰酶和雙抗為美國Gibco公司產品；ox-LDL和RIPA裂解液為北京索萊寶生物科技有限公司產品；胎牛血清為美國Invitrogen公司產品；CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒和Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒為上海碧云天生物技術研究所產品；人IL-1β和TNF-α ELISA試劑盒為杭州聯科生物公司產品；重組Anti-Cathepsin S抗體（ab134157）、重組Anti-CD31抗 體（ab76533）、Anti-Vimentin抗 體（ab16700）為Abcam公司產品；VE-Cadherin兔單克隆抗體（#2158）、α-Smooth Muscle Actin兔單克隆抗體（#19245）、Phospho-p38 MAPK（Thr180/Tyr182）兔單克隆抗體（#4511）、p38 MAPK兔單克隆抗體（#8690）為美國Cell Signaling Technology公司產品；GAPDH兔多克隆抗體為武漢博士德生物工程有限公司產品；茴香霉素（Anisomycin，AM）為美國Selleck公司產品；CTSS siRNA序列5'-CAGCCAGTGGCAGAGAAATATCACA-3'，對照siRNA序列5'-CAGGTGAGACGAAGATATACCCACA-3'，序列由上海吉瑪生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和分組處理 將胰酶消化的對數生長期的HUVECs細胞接種到細胞培養板中，加入含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的DMEM培養基，然后置于37 ℃含5%CO2的細胞培養箱中培養。細胞貼壁后，將細胞分成4組：對照組、ox-LDL組、ox-LDL+si-CTSS組、ox-LDL+si-NC組。ox-LDL組加入100 μg/ml ox-LDL孵育24 h，ox-LDL+si-CTSS組先使用轉染試劑將CTSS siRNA轉染至細胞中48 h再加入100 μg/ml ox-LDL孵育24 h，ox-LDL+si-NC組先使用轉染試劑將對照siRNA轉染至細胞中48 h再加入100 μg/ml ox-LDL孵育24 h，對照組不進行處理。

1.2.2 細胞增殖檢測 使用CCK-8試劑盒檢測細胞活力。按照1×104個/ml的密度將HUVECs細胞接種到96孔板中，貼壁后按照上述分組處理細胞，ox-LDL加入24 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液在37 ℃條件下繼續培養1 h。然后用酶標儀在450 nm波長處檢測各孔的吸光值。

1.2.3 細胞凋亡檢測 用流式細胞術檢測各組細胞凋亡。具體操作如下：按照1.5×105個/孔的密度將HUVECs細胞接種到6孔板中，轉染48 h后使用100 μg/ml ox-LDL繼續處理24 h。收集各組細胞，PBS緩沖液清洗3次，用500 μl 結合緩沖液重懸細胞，然后加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI溶液37 ℃避光孵育15 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 ELISA檢測細胞因子表達和Western blot檢測 收集各組細胞的上清液用ELISA試劑盒檢測細胞因子表達。使用RIPA裂解液從各組HUVECs細胞中提取總蛋白。冰浴15 min，4 ℃、12 000 g離心10 min收集上清液即為所提取總蛋白。按照BCA試劑盒的說明書操作測定蛋白濃度。之后，將等量的蛋白樣品煮沸5 min，用SDS-PAGE電泳根據分子量大小將蛋白進行分離。將蛋白轉移到PVDF膜上，然后用5%脫脂奶粉在室溫條件下封閉2 h以阻止非特異性結合，加入適當稀釋倍數的一抗4°C過夜孵育。用TBS緩沖液清洗膜3次，加入二抗室溫孵育1 h；用含有0.1%吐溫20的TBS緩沖液清洗膜3次后加入ECL發光液觀察蛋白條帶。使用Image J軟件對條帶的光度值進行分析，以GAPDH為內參。1.3 統計學分析 所有實驗均重復3次，數據采用±s表示，用SPSS19.0軟件進行統計分析。兩組間差異的比較用Student'st檢驗；多組間差異比較采用單因素方差分析并進行Tukey事后檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ox-LDL可上調內皮細胞中CTSS表達 使用100 μg/ml ox-LDL處理24 h后，檢測對照組和ox-LDL組中CTSS蛋白表達。結果如圖1所示：與對照組相比，ox-LDL組中CTSS蛋白表達增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 ox-LDL可上調內皮細胞中CTSS表達Fig.1 ox-LDL upregulated CTSS expression in endothelial cells

2.2 下調CTSS可增加ox-LDL抑制的內皮細胞增殖 HUVECs細胞轉染CTSS siRNA或者對照siRNA 72 h后，Western blot檢測CTSS的表達情況，發現與ox-LDL組相比，ox-LDL+si-CTSS組中CTSS 蛋白表達降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；但與ox-LDL相比，ox-LDL+si-NC組中CTSS蛋白表達變化不大，差異無統計學意義（P＞0.05，圖2A、B）。CCK-8檢測細胞活力，結果顯示：與對照組相比，ox-LDL組中細胞活力降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與ox-LDL組相比，ox-LDL+si-CTSS組中細胞活力增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；但是與ox-LDL組相比，ox-LDL+si-NC組中細胞活力變化不大，差異無統計學意義（P＞0.05，圖2C）。

圖2 下調CTSS可增加ox-LDL抑制的內皮細胞增殖Fig.2 Downregulation of CTSS promoted endothelial cell proliferation suppressed by ox-LDL

2.3 下調CTSS可緩解ox-LDL誘導的內皮細胞凋亡 流式檢測細胞凋亡，結果見圖3：與對照組相比，ox-LDL組中細胞凋亡率升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與ox-LDL組相比，ox-LDL+si-CTSS組中細胞凋亡率降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；但是與ox-LDL組相比，ox-LDL+si-NC組中細胞凋亡率變化不大，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖3 下調CTSS可緩解ox-LDL誘導的內皮細胞凋亡Fig.3 Downregulation of CTSS alleviated ox-LDL-induced apoptosis of endothelial cells

2.4 下調CTSS減少ox-LDL誘導的炎癥因子表達 ELISA方法檢測各組細胞中炎癥因子IL-1β和TNF-α含量，結果見圖4：與對照組相比，ox-LDL組中IL-1β和TNF-α含量均增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與ox-LDL組相比，ox-LDL+si-CTSS組IL-1β和TNF-α含量均降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；但是與ox-LDL組相比，ox-LDL+si-NC組中兩種細胞因子變化不大，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖4 下調CTSS減少ox-LDL誘導的炎癥因子IL-1β和TNF-α表達Fig.4 Downregulation of CTSS reduced ox-LDL-induced expression of IL-1β and TNF-α

2.5 下調CTSS抑制ox-LDL誘導的內皮間質轉化 顯微鏡觀察各組細胞形態，見圖5A：對照組細胞呈現規則的鵝卵石樣，ox-LDL組中多數細胞變成紡錘樣，ox-LDL+si-CTSS組中細胞多數呈鵝卵石樣，ox-LDL+si-NC組中細胞多數呈紡錘樣。Western blot檢測內皮細胞標志物CD31和VE-cadherin以及間質細胞標志物α-SMA和Vimentin蛋白表達水平，結果見圖5B～F：與對照組相比，ox-LDL組中CD31和VE-cadherin的表達降低，α-SMA和Vimentin表達升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與ox-LDL組相比，ox-LDL+si-CTSS組CD31和VE-cadherin的表達增加，α-SMA和Vimentin表達降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；但是與ox-LDL組相比，ox-LDL+si-NC組中上述4種蛋白表達變化均不大，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖5 下調CTSS抑制ox-LDL誘導的內皮間質轉化Fig.5 Downregulation of CTSS reduced ox-LDL-EndMT in endothelial cells

2.6 下調CTSS通過抑制p38 MAPK通路發揮作用 Western blot檢測各組p38表達情況，結果見圖6A、B：與對照組相比，ox-LDL組中p-p38/t-p38水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與ox-LDL組相比，ox-LDL+si-CTSS組中p-p38/t-p38水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；但是與ox-LDL組相比，ox-LDL+si-NC組中此比值變化不大，差異無統計學意義（P＞0.05）。此外，在加入ox-LDL前在細胞中加入1 μmol/L p38 MAPK激活劑AM處理1 h，結果發現，與ox-LDL+si-CTSS組相比，ox-LDL+si-CTSS+AM組中細胞活力減弱，TNF-α含量增多，CD31的表達降低，α-SMA表達升高，差異均具有統計學意義（P＜0.05）；但是ox-LDL+si-CTSS+AM組中細胞活力和CD31表達仍高于ox-LDL組，TNF-α含量和α-SMA表達仍低于ox-LDL組（圖6C～G）。

圖6 下調CTSS通過抑制p38 MAPK通路發揮作用Fig.6 Downregulation of CTSS functioned via inhibiting activation of p38 MAPK pathway

2.7 下調CTSS對Akt和ERK1/2通路的影響 Western blot檢測各組Akt和ERK1/2通路蛋白，結果見圖7：與對照組相比，ox-LDL組中p-Akt/Akt和p-ERK1/2/ERK1/2水平均升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與ox-LDL組相比，ox-LDL+si-CTSS組中p-Akt/Akt和p-ERK1/2/ERK1/2水平均降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；但是與ox-LDL組相比，ox-LDL+si-NC組中這兩者的比值變化不大，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖7 下調CTSS可抑制ox-LDL誘導的Akt和ERK1/2通路活化Fig.7 Downregulation of CTSS inhibited ox-LDL-induced activation of Akt and ERK1/2 signaling pathways

3 討論

組織蛋白酶是能夠分解與特定氨基酸相連接肽鍵的溶酶體蛋白酶，它們在蛋白質轉換和胞外基質的降解中發揮重要作用。最近的研究發現組織蛋白酶與多種疾病的發生密切相關，如自身免疫性疾病、心臟修復、心肌病和動脈粥樣硬化［11］。組織蛋白酶家族由11個成員組成，其中CTSS被認為是一種能有效切割彈性蛋白酶產生有活性的彈性蛋白多肽，引起心血管炎癥和鈣化的半胱氨酸蛋白酶［11］。研究發現，CTSS在動脈粥樣硬化組織和血清中高表達，且參與了動脈粥樣硬化的發展過程［8-10］。文獻已經證實CTSS可表達于內皮細胞［12］，但是目前CTSS在動脈粥樣硬化中內皮細胞損傷中的作用還未見相關報道。因此，本研究從體外實驗進一步探究CTSS在動脈粥樣硬化內皮細胞損傷中的作用。本研究結果發現CTSS在ox-LDL誘導的內皮細胞中表達上調，這與其在動脈硬化斑塊中表達趨勢相一致［8］。由此推測CTSS在動脈粥樣硬化內皮損傷過程中發揮著重要作用。

Ox-LDL誘導的內皮細胞損傷在動脈粥樣硬化中發揮著關鍵作用，因此本課題進一步探究了CTSS在ox-LDL誘導的內皮細胞損傷中的作用［13］。文獻報道ox-LDL可誘導內皮細胞凋亡、炎癥和End-MT［14］。在患者的動脈粥樣硬化斑塊中EndMT的程度與疾病的嚴重程度密切相關，且EndMT可導致內皮細胞來源的間充質細胞向底層組織的分層和遷移，引起動脈粥樣硬化的發生和發展［15］。CD31和VE-cadherin是重要的內皮細胞標志物，而α-SMA和Vimentin是重要的間質細胞標志物。發生EndMT時，內皮細胞的形態發生變化，變成紡錘樣，并伴隨著CD31和VE-cadherin表達下降，α-SMA和Vimentin表達增加［16-17］。血管內皮細胞炎癥會刺激鄰近的血管平滑肌細胞表型的改變，進一步導致動脈粥樣硬化進展［18］。本研究結果顯示ox-LDL可抑制HUVECs細胞增殖，誘導細胞凋亡，增加炎癥因子IL-1β和TNF-α含量，誘導細胞EndMT，這表明本課題組成功誘導了內皮細胞損傷模型。在ox-LDL損傷的內皮細胞中通過siRNA技術下調CTSS可促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，減少炎癥因子IL-1β和TNF-α含量，抑制EndMT。本研究表明在動脈粥樣硬化模型中，抑制CTSS表達可通過抑制內皮細胞凋亡，減少EndMT和炎癥反應，減輕內皮細胞損傷，從而抑制中膜增厚，緩解動脈粥樣硬化進展。

本課題組進一步探究了CTSS對ox-LDL誘導的內皮細胞損傷的作用機制。促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族是一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與細胞生長、增殖、凋亡和功能的調控［19］。MAPK家族主要包括p38 MAPK、JNK、ERK1/2三個主要成員。p38 MAPK可通過多種方式促進動脈粥樣硬化的發生［20］。研究發現ox-LDL可通過LOX-1受體誘導內皮細胞中p38 MAPK通路活化。阻斷p38 MAPK通路的活化可緩解ox-LDL誘導的內皮細胞凋亡、炎癥和EndMT［19，21-22］。LIN等［8］的研究發現下調CTSS可緩解ox-LDL誘導的骨髓來源的巨噬細胞向泡沫細胞轉化、脂質積累和遷移等動脈粥樣硬化相關表型，這也與p38 MAPK通路的活化被抑制有關。本研究結果也顯示ox-LDL處理可增加HUVECs細胞中p38 MAPK通路的活化，下調CTSS可減少ox-LDL誘導的p38 MAPK的磷酸化，而且p38 MAPK激活劑可逆轉CTSS下調對細胞增殖、炎癥和EndMT的影響。這表明下調CTSS緩解ox-LDL誘導的內皮細胞損傷是通過抑制p38 MAPK通路發揮作用的。但是p38 MAPK激活劑并沒有完全逆轉CTSS下調對內皮細胞損傷的作用，這表明可能還有其他通路也參與了CTSS的調節作用。曾有研究表明除了p38 MAPK通路外，CTSS在內皮細胞中還可調節Akt和ERK1/2通路，且ox-LDL可通過Akt和ERK1/2通路誘導內皮細胞損傷［6，23-24］。同樣，本研究結果顯示ox-LDL可誘導Akt和ERK1/2通路活化；下調CTSS可抑制ox-LDL活化的Akt和ERK1/2通路。因此，CTSS也可通過Akt和ERK1/2通路調節ox-LDL誘導的內皮細胞損傷。總之，本研究結果顯示，CTSS在ox-LDL刺激的HUVECs細胞中表達上調。下調CTSS可通過抑制p38 MAPK通路的活化部分緩解ox-LDL誘導的細胞凋亡、炎癥和EndMT。同時，CTSS的作用也與Akt和ERK1/2通路的活化有關。本課題組通過體外實驗進一步證實了抑制CTSS表達可通過減輕內皮損傷緩解動脈粥樣硬化進展，但是其詳細的分子機制有待進一步確證。