外周血Th9/Treg在不同程度慢性乙型病毒性肝炎患者中的變化及意義

郭艷，劉肄輝，李華銘，王宇芳，李春霞

慢性乙型病毒性肝炎（CHB）發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明，乙型肝炎病毒（HBV）引起的免疫反應(yīng)是肝臟炎癥發(fā)生的主要機(jī)制，與細(xì)胞免疫密切相關(guān)。近年來，CD4+T輔助性（Th）細(xì)胞的幾個(gè)主要亞群，如Th1、Th2和Th17細(xì)胞，已被證明在HBV誘導(dǎo)的肝臟炎癥的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1]。Th9細(xì)胞是CD4+T淋巴細(xì)胞亞群新成員，研究認(rèn)為其在CHB中起促炎作用[2]，其在分化與功能上與調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（Treg細(xì)胞）具有一定的相關(guān)性。目前研究認(rèn)為，Treg細(xì)胞在CHB中主要起免疫抑制作用[3]，而對(duì)Th9/Treg在HBV感染中的變化研究較少。本研究旨在觀察Th9、Treg及Th9/Treg在不同程度CHB患者中的變化趨勢(shì)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年1月至2020年12月浙江省杭州市第三人民醫(yī)院收治的HBV感染者150例，分為HBV攜帶組、輕度CHB組、中度CHB組、重度CHB組及乙肝肝硬化組，每組各30例。均符合《慢性乙型肝炎防治指南2019年版》中HBV感染診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。CHB分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考《病毒性肝炎防治方案2000版》[5]：輕度CHB，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）≤3 ULN，總膽紅素（TBiL）≤2 ULN；中度CHB，ALT＞3 ULN，5 ULN＞TBiL＞2 ULN；重度CHB，ALT＞3 ULN，TBiL＞5 ULN；乙肝肝硬化，Child-Pugh分級(jí)≥5分，診斷為肝硬化。排除甲型肝炎病毒（HAV）、丙型肝炎病毒（HCV）及戊型肝炎病毒（HEV）等感染，排除合并脂肪性、酒精性和遺傳代謝性肝病、失代償性慢性肝病以及自身免疫相關(guān)的其他疾病，排除心腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)重大疾病及精神病患者，排除妊娠或哺乳期婦女。所有患者未接受過抗病毒治療或免疫調(diào)節(jié)治療。

同時(shí)選擇健康志愿者20名作為對(duì)照組。本研究經(jīng)杭州市第三人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法 記錄患者及健康志愿者的性別及年齡，完成HBV血清學(xué)標(biāo)志物、血清肝功能、HBV-DNA、外周血Th9及Treg等指標(biāo)檢測(cè)。

HBV血清標(biāo)志物采用化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)（美國雅培I-2000全自動(dòng)免疫發(fā)光分析儀），ALT采用全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀檢測(cè)（日本日立全自動(dòng)7180生化儀），HBV-DNA采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)（美國ABI公司ABI7000型全自動(dòng)熒光定量PCR系統(tǒng)）。TBiL參考范圍0～21mol/L，ALT參考范圍0～50 U/L，HBV-DNA最低檢測(cè)下限為＜30 IU/ml。

流式細(xì)胞儀購自美國Thermo Attune，Anti-Human CD3及FITC購自MultiSciences，Anti-Human CD8及PE-Cy7購自MultiSciences，IL-9 Monoclonal Antibody(MH9D1)及PerCP-eFluor 710購自eBioscience，Human Regulatory T CellStaining Kit購自MultiSciences，PMA/Ionomycin mixture（250X）佛波酯/離子霉素混合物購自MultiSciences，BFA/Monensin Mixture（250X）布雷非德菌素A/莫能霉素混合物購自MultiSciences，F(xiàn)ix&Perm Kit固定破膜劑購自MultiSciences。檢測(cè)方法及步驟均按常規(guī)流程進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用檢驗(yàn)，多重比較采用LSD-檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBV感染組與對(duì)照組指標(biāo)比較 兩組性別比、年齡及Th9/Treg值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），TBiL、ALT、Th9及Treg水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 HBV感染組與對(duì)照組指標(biāo)比較

2.2 不同程度CHB患者Th9及Treg細(xì)胞水平變化5組性別比、年齡及HBV-DNA差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），TBiL、ALT、Th9、Treg及Th9/Treg差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2 不同程度CHB患者中Th9及Treg細(xì)胞水平變化

2.3 Th9及Treg水平與TBiL、ALT及HBV-DNA的相關(guān)性 Th9與Treg呈負(fù)相關(guān)（r=-0.485，P=0.000）；Th9細(xì)胞與ALT呈正相關(guān)（r=0.364，P=0.000），與TBIL呈正相關(guān)（r=0.407，P=0.000），與HBV-DNA呈負(fù)相關(guān)（r=-0.076，P=0.353）；Treg細(xì)胞與ALT呈負(fù)相關(guān)（r=-0.188，P=0.02），與TBIL呈負(fù)相關(guān)（r=-0.146，P=0.075），與HBV-DNA呈負(fù)相關(guān)（r=-0.035，P=0.667）。

3 討論

先天免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞在控制HBV感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但它們也可引起炎癥，并隨后導(dǎo)致肝臟病理。在HBV感染的初始階段，先天免疫被觸發(fā)，導(dǎo)致抗病毒細(xì)胞因子的產(chǎn)生，隨后適應(yīng)性免疫系統(tǒng)被激活并在肝內(nèi)招募，從而成功清除病毒，若免疫系統(tǒng)未能清除病毒則轉(zhuǎn)為HBV感染。HBV感染的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，迄今尚未完全闡明，HBV不直接殺傷肝細(xì)胞，病毒引起的免疫反應(yīng)是一把雙刃劍，它通過破壞病毒感染細(xì)胞來抵抗感染，同時(shí)引起肝臟炎癥，加重肝臟損傷，是導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷及炎癥壞死的主要機(jī)制[6]，HBV特異性（適應(yīng)性）免疫應(yīng)答在清除HBV中起主要作用。越來越多的證據(jù)表明，CD4+T細(xì)胞亞群在肝臟炎癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，CD4+T細(xì)胞反應(yīng)不足可導(dǎo)致持續(xù)性HBV感染及慢性炎癥，CD4+T細(xì)胞包括Th1、Th2、Th17、Th9及Treg等。

Th9是以分泌IL-9為特征的CD4+T細(xì)胞亞群，諸多研究認(rèn)為其參與了CHB的發(fā)病機(jī)制[2]。魏金剛等[7]認(rèn)為HBV感染者外周血Th9較健康對(duì)照組明顯升高，Th9細(xì)胞與HBV持續(xù)性感染及高復(fù)制狀態(tài)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)外周血Th9在HBV感染者中較健康對(duì)照組明顯升高，與筆者前期研究及多數(shù)研究一致[2，7-8]，但Cui等[9]的研究認(rèn)為HBV感染患者外周血Th9細(xì)胞頻率明顯降低，Yu等[10]研究發(fā)現(xiàn)CHB外周血Th9細(xì)胞與健康對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。出現(xiàn)這種差異的原因可能與入組病例不同及樣本數(shù)量有關(guān)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，隨著CHB損傷程度的加重，Th9細(xì)胞頻率逐步升高，5組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；相關(guān)性分析Th9與TBIL、ALT均呈正相關(guān)，提示Th9可能起促炎作用，其與HBV-DNA載量呈負(fù)相關(guān)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），Cui等的研究也認(rèn)為Th9細(xì)胞與HBVDNA載量呈負(fù)相關(guān)，這說明Th9細(xì)胞促炎作用的雙重反應(yīng)，即炎癥反應(yīng)同時(shí)也促進(jìn)了病毒的清除。

而另一類CD4+T細(xì)胞亞群Treg細(xì)胞被認(rèn)為通過抑制各種類型的細(xì)胞，包括樹突狀細(xì)胞（DC）、自然殺傷細(xì)胞（NK）、CD4+T和CD8+T細(xì)胞，在免疫耐受的發(fā)展和維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。在急性HBV感染期間，Treg保護(hù)肝臟免受免疫介導(dǎo)的肝損傷，而在慢性HBV感染中，Treg參與了肝硬化的發(fā)展以及進(jìn)一步向肝癌的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移，提示Treg在不同疾病階段發(fā)揮不同的作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性HBV感染者外周血Treg較健康對(duì)照組明顯升高，與其他研究一致[13-14]。與Th9不同，隨著肝損傷程度的加重，Treg逐漸降低，5組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；相關(guān)性分析提示，Treg與ALT呈負(fù)相關(guān)，Tre g可能通過抑制Th9細(xì)胞起抗炎作用。本研究結(jié)果Treg與HBV-DNA無明顯相關(guān)性，但詹愛琴等[13]研究認(rèn)為Treg水平與HBV-DNA載量呈正相關(guān)。

有諸多研究認(rèn)為，Th17/Treg平衡失衡是導(dǎo)致CHB患者持續(xù)病毒感染的重要機(jī)制[15]。本研究結(jié)果提示，慢性HBV感染者Th9/Treg與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與筆者前期研究不一致[8]，可能與入組樣本不同有關(guān)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，Th9/Treg隨著肝臟損傷程度的增加而升高，與CHB損傷程度有關(guān)，Th9及Treg兩者之間可能存在動(dòng)態(tài)變化，從而出現(xiàn)肝臟的免疫耐受或免疫激活，是否影響預(yù)后尚需進(jìn)一步研究。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 郭艷、劉肄輝：實(shí)驗(yàn)操作、論文撰寫；王宇芳、李春霞：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；李華銘：研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費(fèi)支持