飼喂仿刺參性腺對小鼠免疫功能的調節作用

李 倩，教 楊，劉 淇，張 媛，趙 玲，孫慧慧，曹 榮,*

（1.中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東 青島 266071；2.廣州工商學院工學院，廣東 廣州 510850；3.獐子島集團股份有限公司，遼寧 大連 116001）

海參是藥食同源的典范，食用歷史悠久，保健功效深入人心。隨著國民經濟的發展和人均可支配收入的增加，吃海參逐漸成為人們日常養生的一種潮流。與此同時，海參養殖技術不斷進步和完善，有力推動了海參產業的快速發展。2021年全國仿刺參總產量達22.27 萬t[1]，全產業鏈產值估算超1 000 億元。海參營養功效與加工一直是國內的研究熱點。“十五”以來，科研人員先后在海參自溶機制與控制、海參功能成分與構效關系解析、海參加工技術與產品標準等方面取得了重要進展。與此同時，海參加工產業依舊面臨一些問題，尤為突出的是海參在加工過程中會產生30%左右的副產物（海參腸、性腺、呼吸樹等組織），目前利用率極低[2]，部分甚至直接丟棄，既浪費資源又污染環境。

海參性腺，俗稱海參花，富含優質蛋白質以及海參多糖、海參皂苷、功能脂質等活性成分[3]，是生產功 能性海洋制品的潛在原料。科研人員從海參性腺中提取到多種活性物質，并驗證了其功能活性，如體外抗氧化活性[4]、抗腫瘤[5]及促進生殖系統健康[6-7]等。而目前有關海參性腺在免疫調節方面的研究報道還非常少。常年吃海參的人群不易感冒，普遍認為與食用海參可以提高人體免疫力有關[8]，通常人們食用的部分為海參體壁。而仿刺參性腺是否具有免疫功效，目前尚沒有相關的研究證明。由此，本研究以仿刺參雌、雄性腺為原料，對其基本營養組分和主要功效成分進行測定，采用小鼠飼喂實驗，通過分析臟器指數、血清生化指標、肝臟生化指標等考察仿刺參性腺在小鼠免疫力調節方面的作用，以期為仿刺參性腺的精深加工與產品開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

仿刺參雌、雄性腺由青島海濱食品有限公司提供，系2020年春季采捕仿刺參時現場分離得到，雌、雄性腺分別分裝于樣品袋中，立即冷凍處理。SPF級雄性昆明小鼠，體質量（20.0±2.0） g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。

Hank’s液、RPMI1640等細胞培養液 海克隆生物化學有限公司；胎牛血清 賽默飛世爾科技有限公司；小鼠淋巴瘤YAC-1細胞 中國科學院細胞庫；2-巰基 乙醇 寶日醫生物技術有限公司；青霉素、鏈霉素 上海生物工程股份有限公司；紅細胞裂解液 北京索萊寶科技有限公司；噻唑藍 美國Sigma公司；濃鹽酸、氯仿、甲醇、磺基水楊酸、氫氧化鈉（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；灌胃器、注射器、凍存管、96 孔培養板、無菌濾器 青島阿貝特儀器科技有限公司。

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；小鼠白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）、酶聯免疫吸附測定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒 上海酶聯生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

G50型組織研磨器 卡尤迪生物科技有限公司；Spectra Max i3x型酶標儀 美國Molecular Devices公司；DHG-9423A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏設備有限公司；UV-2802型紫外-可見分光光度計 尤尼柯儀器有限公司；MARS Xpress型微波消解儀 美國CEM公司；5810R型冷凍離心機 德國艾本德公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

仿刺參雌、雄性腺分別真空冷凍干燥處理，研磨成粉末，備用；體壁切塊后進行真空冷凍干燥處理，研磨成粉末，備用。將仿刺參雌、雄性腺鮮樣分別勻漿，制得勻漿液備用。

1.3.2 基本化學成分與功效成分測定

蛋白質含量測定：參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》[9]中的凱氏定氮法。脂肪含量測定：參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》[10]中的索氏提取法。灰分含量測定：參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》[11]中的高溫灼燒法。海參多糖含量測定：參照常耀光[12]的方法。海參皂苷含量測定：參照高子陽等[13]的方法。

1.3.3 小鼠飼喂

小鼠預飼1 周，之后隨機分為3 組，每組20 只，即：對照組、飼喂雌性性腺組（灌胃仿刺參雌性性腺勻漿液）、飼喂雄性性腺組（灌胃仿刺參雄性性腺勻漿液）。每周測定小鼠體質量，灌胃劑量按照 2.6 mg/（g·d）計算，對照組灌胃同等體積的蒸餾水。連續灌胃30 d，飼喂結束后進行各項指標測定。

1.3.4 臟器指數測定

摘取小鼠胸腺和脾臟，分別稱質量，胸腺指數和脾臟指數分別按式（1）～（2）計算。

1.3.5 自然殺傷（natural killer，NK）細胞活性率測定

實驗前24 h將靶細胞YAC-1進行傳代培養，用Hank’s液洗3 次，用RPMI1640完全培養液調整細胞濃度為4×105個/mL。

無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’s液的小平皿中，輕輕將脾磨碎，制成單細胞懸液，經200 目篩網過濾，用Hank’s液洗2 次，3 500 r/min離心10 min棄上清，加入0.5 mL細胞裂解液20 s，再加入0.5 mL 2 倍Hank’s液及8 mL Hank’s液，1 000 r/min離心10 min，用1 mL含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養液重懸，稀釋后進行活細胞計數，用RPMI1640完全培養液調整細胞濃度為2×107個/mL，作為效應細胞。同時設定靶細胞孔和效應細胞孔。細胞于37 ℃、5% CO2培養箱中培養后，用酶標儀在490 nm波長處測定光密度（OD），NK細胞活性率按式（3）計算。

1.3.6 血清生化指標測定

末次灌胃后禁食不禁水12 h，小鼠稱質量，摘眼球取血，靜置30 min，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，取血清。按照試劑盒說明書步驟，測定血清IL-2、IL-6、TNF-α、MDA、GSH含量及LDH、SOD活性。

1.3.7 肝臟生化指標測定

取血后小鼠脫頸處死，無菌環境下，取脾臟、胸腺和肝臟，冷生理鹽水清洗，稱質量。肝臟勻漿，按照試劑盒說明書步驟，測定勻漿液中的GSH、MDA含量及SOD、LDH、CAT活性。

1.4 數據處理

營養和功效成分含量測定實驗重復2 次，每次3 個平行，小鼠實驗結果為20 個樣本的平均值，結果用平均 值±標準差表示。使用SPSS軟件的Duncan’s法進行組間差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 仿刺參性腺基本營養組成與功效成分

由表1可知，仿刺參雌、雄性腺與體壁的蛋白質、脂肪、灰分含量以及海參多糖、海參皂苷含量有明顯差別。三者的蛋白質含量有顯著差異（P＜0.05），其中雄性性腺蛋白質含量最高，而雌性性腺蛋白質含量最低，這與張健等[14]的研究結果類似。仿刺參體壁的脂肪含量較低，而雌、雄性腺的脂肪含量均顯著高于體壁（P＜0.05），尤其是雌性性腺的脂肪含量達到15.93 g/100 g，是體壁的近4 倍。雌、雄性腺的灰分含量均顯著低于體壁（P＜0.05），這與仿刺參體壁含有內骨骼及沙嘴有關。

表1 仿刺參性腺與體壁基本營養成分與功效成分含量（干基）Table 1 Basic nutrients and functional compounds contents in gonads and body wall of Apostichopus japonicus (on a dry basis)g/100 g

海參多糖和海參皂苷是海參特有的功能活性成分，已被證實具有多種生理功能[15]。與仿刺參體壁相比，雄性性腺中海參多糖含量顯著偏低（P＜0.05），而雌性性腺的海參多糖含量與體壁相當。雌性性腺的海參皂苷含量高達4.77 g/100 g，是體壁的10 倍以上。因此，仿刺參性腺在功能食品方面具有良好的開發利用前景。

2.2 小鼠體質量與臟器指數

由表2可知，小鼠飼喂30 d后，體質量明顯增加，但3 組小鼠的終體質量并無顯著差異。胸腺的主要功能是產生T淋巴細胞和分泌胸腺素，參與細胞免疫。脾臟中有豐富的B淋巴細胞和巨噬細胞，與體液免疫關系更為密切。胸腺指數和脾臟指數升高，表明免疫器官內淋巴細胞數量增多，可在一定程度上反映機體免疫功能的強 弱[16]。喂食仿刺參雄性性腺的小鼠，脾臟指數和胸腺指數均顯著增加（P＜0.05）；喂食雌性性腺的小鼠，脾臟指數顯著增加（P＜0.05），胸腺指數同樣有所提高，但與對照組相比差異不顯著。由此可知，仿刺參雌、雄性腺對小鼠的免疫功能均可起到一定的促進作用，且雄性性腺的效果相對更好。

表2 小鼠體質量及臟器指數Table 2 Body mass and organ indices of mice

研究表明，海參中的多種成分都具有提高免疫力的作用，如海參多糖[17]、海參皂苷[18]、海參肽[19]等。食品原料本身是一個復雜體系，多組分之間可能存在協同效應[20]，且這種協同作用對整體功效的貢獻可能更大。因此，對原料本身而非純化組分開展功效研究同樣十分必要。李艷菊等[21]研究發現，食用海參可顯著提高小鼠的體液免疫應答功能；陳垚[22]將海參凍干粉與茯苓、枸杞等配伍，同樣發現其具有理想的增強免疫力效果。

2.3 NK細胞活力

NK細胞在生物體非特異性免疫中有重要作用，其殺傷作用不需要預先免疫或致敏，且殺傷作用早于其他效應細胞，在抗病毒、抗腫瘤及免疫調節方面有積極作用，同時可以調節T淋巴細胞、B淋巴細胞等[23]。因此，發現可增強NK細胞活性的化合物具有重要意義。

由圖1可知，飼喂仿刺參性腺的小鼠，其NK細胞活力顯著提升（P＜0.05），且飼喂雄性性腺組提升更為明顯，經測定其NK細胞活性率可達（47.19±4.99）%，表明仿刺參性腺在提高小鼠免疫力方面具有積極作用，這與臟器指數的檢測結果一致。

圖1 飼喂仿刺參性腺對小鼠NK細胞活力的影響Fig. 1 Effect of feeding Apostiopsis japonicus gonads on NK cell activity of mice

2.4 血清生化指標檢測結果

白細胞介素是對免疫功能有重要調節作用的一類細胞因子，在傳遞信息、激活與調節免疫細胞以及炎癥反應中起重要作用。其中，IL-2對淋巴細胞的生長、增殖、分化起促進作用，可以激活巨噬細胞，刺激免疫應答[24]。IL-6主要由活化的T細胞和成纖維細胞產生，能加快B細胞轉化、促進原始骨髓源細胞的生長和分化，增強NK細胞裂解功能等。由表3可知，飼喂仿刺參性腺的小鼠，其IL-2含量略有增加，但與對照組相比差異并不顯著，而IL-6含量變化更為明顯，其中飼喂仿刺參雄性性腺組的IL-6含量顯著增加（P＜0.05）， 為（209.75±24.82） pg/mL。

表3 飼喂仿刺參性腺對小鼠血清生化指標的影響Table 3 Effect of feeding Apostiopsis japonicus gonads on serum biochemical indices of mice

TNF-α主要由脂肪組織中的巨噬細胞和脂肪細胞分泌產生，與免疫調控、抑制腫瘤細胞生長有關。楊東達[25]從海參內臟中分離出SCVP-1和SCVP-2 2 種多糖組分，發現SCVP-1可以顯著提高小鼠血清中TNF-α含量，增強小鼠免疫活性。飼喂仿刺參性腺的小鼠，其血清中TNF-α含量略有增加，但與對照組相比差異并不顯著，雌性性腺組對應的TNF-α含量增加更為明顯，可能與雌性性腺中海參多糖的含量更高有關[26]。

SOD是存在于機體內的一種可清除超氧自由基的酶，其活性不僅在一定程度上反映了機體抗氧化和抗衰老作用的強弱，還可在一定程度上反映機體免疫活性，如抗炎癥能力等[27]。與對照組相比，飼喂雄性性腺的小鼠，其SOD活力顯著升高（P＜0.05），為（18.61±0.28） U/mL。飼喂雌性性腺的小鼠，其SOD活力也略有升高，但與對照組相比差異不顯著。LDH存在于組織細胞內，其主要功能是將運動所致肌肉中堆積的乳酸轉變為丙酮酸，減少乳酸在肌肉中的堆積。LDH活力越高，表明機體對運動時所產生的乳酸清除能力越強，進而延緩疲勞的發生或加速疲勞的消除，間接提升機體的免疫功能。飼喂雌性性腺、雄性性腺的小鼠，其LDH活力均顯著提升，分別達（391.01±32.18）、（379.12±18.44） U/L（P＜0.05），且飼喂雌性性腺的小鼠提升更為明顯，這可能與雌性性腺富含極性脂質有關。雌性性腺中脂質含量高達15.93%，其中磷脂、鞘脂類占有相當比例，而海參磷脂可顯著提高生物體SOD、LDH活力[28]。

自由基是影響生物體免疫系統的重要因素。機體中的自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化作用，形成MDA等脂質過氧化物[29]。MDA具有細胞毒性，能加劇膜損傷，引起蛋白質、核酸等大分子的交聯聚合，導致細胞代謝及功能障礙。與對照組相比，飼喂雄性性腺可顯著降低血清中的MDA含量 （P＜0.05），這與SOD活力提高的結果相一致。 付雪媛等[30]研究認為，海參可改善小鼠的抗氧化能力，同時提高免疫力，具體表現為MDA含量減少、SOD活力提升。飼喂雌性性腺也可在一定程度上降低血清中的MDA含量，但與對照組相比差異不顯著。

2.5 肝臟生化指標檢測結果

由表4可知，肝臟生化指標檢測結果與血清類似。飼喂仿刺參雄性性腺組的小鼠，其SOD、LDH活力顯著提升（P＜0.05）（（6.32±0.31） U/mg和（246.77±26.10） U/g），MDA含量顯著下降 （P＜0.05），為（1.98±0.25） nmol/mg。CAT存在于動物的各個組織中，尤其在肝臟中大量存在，是肝臟發揮抗氧化、解毒等作用的物質基礎。飼喂仿刺參雄性性腺組的小鼠，CAT活力略有提高，但與對照組相比差異并不顯著。GSH由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸組成，廣泛存在于機體細胞中，可維持免疫系統正常功能，并具有抗氧化、解毒的作用。飼喂仿刺參雌性性腺、雄性性腺的小鼠，其GSH含量均有所增加，且雄性性腺組增加更為明顯。Meng等[31]研究發現，海參中的蛋白肽可提高機體抗氧化能力、增加GSH含量。仿刺參雄性性腺蛋白含量高，該組的小鼠肝臟GSH含量增加可能與之有關。

表4 飼喂仿刺參性腺對小鼠肝臟生化指標的影響Table 4 Effect of feeding Apostiopsis japonicus gonads on liver biochemical indicators of mice

3 結 論

仿刺參性腺富含營養和功效成分，且雌性性腺和雄性性腺化學組成有明顯不同，雌性性腺富含脂肪和皂苷，而雄性性腺蛋白含量較高。與對照組相比，飼喂仿刺參雄性性腺的小鼠，其胸腺指數和脾臟指數顯著增加（P＜0.05），分別為（4.70±0.36）、（3.70±0.29） mg/g，NK細胞活性顯著提高 （P＜0.05），達（47.19±4.99）%，血清中IL-6含量顯著增加（P＜0.05），為（209.75±24.82） pg/mL，血清和肝臟中LDH、SOD活力均顯著提升（P＜0.05），肝臟MDA含量顯著降低至（1.98±0.25） nmol/mg （P＜0.05）；飼喂仿刺參雌性性腺的小鼠，脾臟指數為（3.14±0.26） mg/g（P＜0.05），血清LDH活力顯著提升（P＜0.05），達（391.01±32.18） U/L。由此可知，飼喂仿刺參性腺可提高小鼠的免疫活性，且飼喂雄性性腺的作用更加明顯。