茶多酚-殼聚糖復合液對虹鱒魚肉貯藏品質和 菌群結構的影響

吳昕寧，李鳴澤，梁釋介，張靖暄，熊 欣，譚雨青，羅永康*

（中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083）

虹鱒（Oncorhynchus mykiss）屬太平洋鮭屬[1]，是典型的冷水魚[2]。虹鱒魚滋味鮮美、營養(yǎng)豐富、生長快、易人工繁殖，是聯(lián)合國糧農組織向世界推廣的產量高且品質優(yōu)良的四大淡水養(yǎng)殖品種之一[3]。虹鱒魚肉具有水分含量高、營養(yǎng)物質豐富、內源酶活性高、pH值近中性等特點，成為微生物適宜的生長繁殖環(huán)境，因此在貯藏、運輸、銷售過程中極易在微生物和內源酶的共同作用下發(fā)生腐敗變質。李東萍等[4]研究發(fā)現，3 ℃冰藏下的虹鱒魚片的貨架期僅有6 d；此外，高不飽和脂肪酸使其極易發(fā)生脂肪氧化，造成魚肉風味、質地劣化，產生不愉快的嗅感和味感[5]。有效的保鮮手段對虹鱒魚貨架期的保障和品質的維持十分重要。

生物保鮮劑在肉類保鮮中應用廣泛[6]。茶多酚是茶葉的主要活性成分[7]，是含有多羥基酚類化合物的復合物，具有顯著的抗氧化活性[8]，是一類水產品抗菌保鮮領域的良好抗菌劑，李雙雙等[9]將其應用于金槍魚保鮮。殼聚糖是幾丁質脫乙酰化后得到的多糖，具有良好的抑菌活性[10]， 周強等[11]將其用于草魚保鮮。目前研究表明，還沒有任何一種抑菌劑有比較全面的抑菌譜，為發(fā)揮協(xié)同保鮮效果，將不同功能生物保鮮劑聯(lián)合使用，互補單一生物保鮮劑在感官及抑菌效果方面的不足，有較強的抑菌效果，能擴大抑菌譜，更好抑制產品腐敗變質，延長其貨架期[12]，因此復合生物保鮮劑具有非常好的應用前景[13]。 茶多酚和殼聚糖的復合保鮮在鮸魚、三文魚、南美白對蝦中均已得到應用[14-16]。

目前在虹鱒魚貯藏加工與品質控制方面已取得初步進展，但在虹鱒魚魚肉貯藏過程中微生物菌群動態(tài)變化規(guī)律、菌群組成與魚肉品質的內在關系和生物保鮮劑控制特定腐敗菌等方面的研究還相對欠缺，需要更加深入的研究。本研究以生鮮虹鱒魚為原料，研究其在（4±1） ℃條件下貯藏時菌群結構的變化，并且通過復配保鮮劑涂膜（茶多酚-殼聚糖），研究復配保鮮劑涂膜對生鮮虹鱒魚肉在（4±1） ℃貯藏過程中品質變化的影響，以期為延長生鮮虹鱒魚肉貯藏時間提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活虹鱒魚購于北京市四道口水產品批發(fā)市場，平均體長（42.59±1.58） cm，平均體質量（0.86±0.09） kg。

茶多酚（純度＞80%） 安徽紅星藥業(yè)股份有限 公司；殼聚糖（純度＞90%、脫乙酰度＞90%） 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

BCD-251 WBCY冰箱 青島海爾股份有限公司；YT-C1-1ND超凈工作臺 北京亞泰科隆實驗科技開發(fā)中心；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；KDY-9820半自動凱式定氮儀 北京通潤源機電儀器設備公司；DSHZ-300A水浴恒溫振蕩器 蘇州培英實驗設備有限公司；GL-21M冷凍離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

鮮活虹鱒魚充氧運輸至中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院。將其迅速敲頭擊暈，去鱗剖腹后取出內臟，切去頭部，用流水沖淋魚體，取背部肌肉分割為8 cm×6 cm×2 cm的魚片并清洗瀝干，將得到的魚片隨機分組。

1.3.2 保鮮劑處理

配制3 g/L溶于水的茶多酚溶液為GTP組，10 g/L溶于體積分數1%乙酸的殼聚糖溶液為CS組，上述茶多酚溶液和殼聚糖溶液等體積混合為MIX組。將生鮮魚片按以上處理組于清潔燒杯常溫浸泡，保持液面完全沒過魚片，10 min后瀝干至無水滴落，裝入食品級聚乙烯袋并編號。未做浸泡處理的空白對照組為CK組。處理后的魚片貯藏于預消毒4 ℃冰箱，分別于0、2、4、6、8 d隨機從每組取3 片進行指標測定。對未到貯藏限值的組別，延長其貯藏期，分別在10、13、15 d測定指標。

1.3.3 感官評價

感官評價參考Berizi[17]、羅忠云[18]等的方法，結合虹鱒魚本身特征作出調整。感官小組由經過專業(yè)感官實驗訓練的6 名實驗室成員組成，含3 名男性和3 名女性，年齡為21～23 歲，感官小組成員分別對魚片的色澤、氣味、質地和彈性進行5 分制打分，評分標準見表1。

表1 虹鱒魚肉感官評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of rainbow trout flesh

1.3.4 菌落總數測定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》。稱取5 g虹鱒魚背部肌肉于無菌均質袋中，再加入45 mL無菌生理鹽水，用拍打式均質機拍打30 s，制得1∶10的樣品稀釋液。之后用4.5 mL無菌生理鹽水連續(xù)10 倍梯度稀釋0.5 mL樣品懸液。選擇2 個合適稀釋度的懸液，吸取100 μL于無菌平板計數瓊脂上涂布。每個稀釋度作2 次平行，并以無菌生理鹽水作為空白對照。操作結束后將培養(yǎng)皿轉移至（30±1） ℃的微生物恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～72 h，菌落清晰可見而不重疊時培養(yǎng)結束。取出進行計數，菌落單位為（lg（CFU/g））。

1.3.5 揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量測定

參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中的半微量定氮法。稱取5 g攪碎的魚片于100 mL離心管中，加入45 mL蒸餾水，均質1 min后在搖床上振蕩30 min，4 ℃條件下4 500 r/min離心3 min。吸取5 mL 10 g/L氧化鎂與5 mL上清液于消化管中，混合均勻后進行蒸餾。錐形瓶中加入100 μL混合指示劑（1 g/L次甲基藍溶液與2 g/L甲基紅-乙醇溶液按體積比1∶1混合）和用于吸收餾出物的10 mL 20 g/L硼酸溶液，蒸餾5 min后，用鹽酸標準溶液（0.01 mol/L）滴定至吸收液呈藍紫色。以5 mL蒸餾水代替樣品懸液為空白對照。

1.3.6 菌群結構測定

取10 g魚片與20 mL無菌生理鹽水混合，漩渦低速振蕩30 s后100 r/min搖床振搖15 min，使魚片表面的微生物分散于生理鹽水。200 r/min離心5 min獲得上清液以去除魚肉，1 000 r/min離心10 min獲得沉淀物。用1.5 mL無菌水洗滌沉淀后，12 000 r/min離心1 min獲得菌體沉淀。參照Liu Xiaochang等[19]的方法提取細菌DNA，將其運送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司[20]，委托該公司采用 第2代測序技術進行聚合酶鏈式反應擴增和產物純化，并通過細菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)的測序分析進行鑒定[21]。

1.4 數據處理

所有指標均測3 個平行，實驗結果用平均值±標準差的形式表示。采用Excel 2016軟件進行統(tǒng)計分析，采用IBM公司SPSS統(tǒng)計軟件進行差異顯著性分析，顯著水平為5%。采用Origin軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 虹鱒魚片4 ℃貯藏過程中的感官評分變化

感官評價是食品領域廣泛采用和認可的評價方法。由圖1可知，貯藏開始，虹鱒魚片色澤、氣味、質地和彈性等感官品質均處于完全新鮮的狀態(tài)，呈明亮的橙黃色，表面顏色鮮亮，肌肉致密緊實、富有彈性。魚片的各項感官評分隨著貯藏時間的延長均下降。由于微生物增殖和脂肪氧化，逐漸色澤暗淡，產生異味，組織松散無彈性。貯藏初期，GTP組的氣味和色澤評分相對CS組較高，可能由于茶多酚本身具有芳香，且對食品中的色素具有保護作用。Gram[22]指出，食品腐敗主要是指食品經感官評價后判定為感官不可接受時的狀態(tài)。通常，將魚肉剛好達到感官不可接受點的時間定義為魚肉的貨架期。本研究將2 分作為不可接受限值，結果表明，貯藏虹鱒魚片的感官貨架期為6～8 d，茶多酚和殼聚糖復合保鮮劑能將貨架期延長至10 d。殼聚糖的抗菌性抑制腐敗變質，茶多酚的抗氧化性抑制脂肪氧化酸敗，結合使用效果更佳。

圖1 虹鱒魚片4 ℃貯藏過程中色澤（A）、氣味（B）、 質地（C）及彈性（D）評分變化Fig. 1 Changes in color (A), odor (B), texture (C) and elasticity (D) of rainbow trout fillets during refrigeration at 4 ℃

2.2 虹鱒魚片4 ℃貯藏過程中的菌落總數變化

水產品的腐敗變質多數是由微生物引起的。由圖2 可知，GTP組、CS組、MIX組虹鱒魚片初始菌落總數分別為3.32、3.27、3.14（lg（CFU/g）），CK組為 3.40（lg（CFU/g）），與MIX組相比有顯著差異 （P＜0.05），表明復配保鮮劑具備一定程度的減菌作用。隨著貯藏時間的延長，各組魚片菌落總數均不斷增長。貯藏8 d時，CK組已達8.07（lg（CFU/g））， 明顯超出SC/T 3116—2006《凍淡水魚片》中淡水魚的上限7.0（lg（CFU/g））；此時，GTP組和CS組分別為7.32、6.02（lg（CFU/g）），MIX組僅有 4.38（lg（CFU/g））；CK組的菌落總數顯著高于其他組（P＜0.05）。貯藏13 d時，MIX組的菌落總數達 7.08（lg（CFU/g）），仍顯著低于單獨處理的GTP組和CS組（P＜0.05）。這說明茶多酚和殼聚糖復配保鮮劑處理可以較好控制虹鱒魚片微生物生長，復合涂膜對虹鱒魚片中菌落的抑制能力強于僅用殼聚糖或茶多酚處理的樣品。現有研究表明，茶多酚對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有明顯抑制作用[23]；殼聚糖通過改變細菌細胞膜的通透性阻礙細胞內外的氣體交換，進而抑制細菌生長繁殖[24]。

圖2 虹鱒魚片4 ℃貯藏過程中菌落總數變化Fig. 2 Changes in total aerobic colony count of rainbow trout fillets during refrigeration at 4 ℃

2.3 虹鱒魚片4 ℃貯藏過程中的TVB-N含量變化

TVB-N是指動物性食品在內源性酶及微生物的作用下使蛋白質分解而產生的氨及胺類等堿性含氮化合物，與微生物活動息息相關[25]，TVB-N含量越高，說明魚片腐敗程度越顯著。由圖3可知，GTP組、CS組、MIX組和CK組虹鱒魚片初始TVB-N含量分別為7.7、6.1、6.3、7.2 mg/100 g，表明魚片的初始質量良好，與成傳香等[26]報道的基本一致。隨著貯藏時間的延長，各組的TVB-N含量均隨貯藏時間延長而逐漸升高，后期由于菌落總數的增長，腐敗加劇而上升明顯。貯藏8 d時，各組之間出現顯著性差異（P＜0.05）。GB 2733—2015《食品安全國家標準 鮮、凍動物性水產品》規(guī)定，淡水魚魚肉TVB-N含量的可接受上限值為20 mg/100 g。貯藏10 d時，CK組增加至23.3 mg/100 g，已超過可接受上限值；而此時GTP組、CS組的TVB-N含量分別增加至16.3、14.9 mg/100 g，均顯著低于CK組（P＜0.05），表明保鮮劑能延緩TVB-N含量的增加；MIX組的TVB-N含量僅為12.1 mg/100 g，顯著低于GTP組和CS組 （P＜0.05），說明復配保鮮劑效果優(yōu)于單獨使用。貯藏13 d時，GTP組、CS組和MIX組的TVB-N含量分別為25.0、19.1、16.1 mg/100 g，MIX組最低。貯藏至15 d，MIX組的TVB-N含量為20.1 mg/100 g，達到上限值。研究[27]顯示，茶多酚處理可以減弱肌肉組織中蛋白質的降解，延緩TVB-N的積累。殼聚糖具有抗菌性能[28]，可能通過抑制微生物進一步延緩含氮物質的分解。

圖3 虹鱒魚片4 ℃貯藏過程中TVB-N含量變化Fig. 3 Changes in TVB-N content of rainbow trout fillets during refrigeration at 4 ℃

2.4 虹鱒魚片4 ℃貯藏過程中的菌群結構分析

2.4.1 高通量測序序列信息及α多樣性分析

在本研究中，基于感官評價和菌落總數結果將0 d作為貯藏的初期，GTP組的6、10 d分別作為茶多酚處理組貯藏的中期和末期，CS組的6、10 d分別作為殼聚糖處理組貯藏的中期和末期，MIX組的8、13 d分別作為茶多酚和殼聚糖復合處理組的中期和末期，CK組的4、8 d分別作為對照組貯藏的中期和末期，通過高通量測序技術進行魚片菌群結構分析。

α多樣性是指一個特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內不同物種種類的豐富程度以及物種數量分布的均勻程度[29]，在本研究中即為虹鱒魚片樣品中微生物的多樣性和豐富程度。覆蓋率是用于評估測序深度的指數，能夠反映測序結果代表樣本中微生物的程度，其值越接近于100%，表明樣品中物種被檢測的概率越高。

由表2可知，各組樣品的覆蓋率均在99.9%以上，說明高通量測序結果可以反映樣品中幾乎全部微生物的群落豐度和多樣性。Ace、Chao 1和Shannon指數分別用來分析微生物群落的豐富度和多樣性[30]。Ace指數和Chao 1指數越大，代表群落物種種類越豐富，Shannon指數越大，說明群落多樣性越低。各組魚片貯藏末期的Ace、Chao 1和Shannon指數均低于0 d，說明隨貯藏時間延長，各組魚片的菌群豐富度呈下降趨勢，這與Zhuang Shuai等[31]的發(fā)現一致，可能由于出現了優(yōu)勢菌屬，抑制其他微生物的生長，從而降低多樣性。另一方面，MIX組貯藏8 d的Ace指數為233.60，遠遠高于CK組貯藏8 d的28.72，及GTP組、CS組貯藏6 d的33.63、175.78，說明茶多酚和殼聚糖的復配處理可以使虹鱒魚片貯藏后期的菌群結構保持較高多樣性。

表2 虹鱒魚片4 ℃貯藏過程中菌群高通量測序信息及α多樣性分析Table 2 High-throughput sequencing information and α-diversity analysis of bacterial flora in rainbow trout meat during refrigeration

2.4.2 菌群分析

微生物是引起魚肉腐敗的主要原因，對虹鱒魚腐敗過程作用至關重要[32]。鑒定魚肉貯藏過程中的菌群結構變化能夠揭示魚肉的腐敗模式和腐敗進程，對生鮮魚肉貯藏保鮮控制技術的開發(fā)具有重要參考價值。高通量測序結果顯示，在各組魚片貯藏過程中，屬水平上共鑒定到16 個相對豐度≥1%的微生物菌種。由圖4可知，貯藏0 d時，魚片優(yōu)勢菌屬為考克氏菌屬（Kocuria），占比26.8%，及假單胞菌屬（Pseudomonas），占比21.9%，此外有巨型球菌屬（Macrococcus）占比8.0%，不動桿菌屬（Acinetobacter）占比7.2%，鏈球菌屬（Streptococcus）占比5.2%。隨著貯藏時間的延長，各組魚片菌群多樣性水平均降低，且假單胞菌屬在各組魚片中的相對豐度持續(xù)增加，并成為優(yōu)勢腐敗菌。Syropoulou等[33]對鱸魚的研究中也發(fā)現，假單胞菌屬是魚片中的主要細菌，它通常來源于魚類生活的環(huán)境。

圖4 虹鱒魚片4 ℃貯藏過程中屬水平微生物相對豐度的變化Fig. 4 Changes in relative abundance of bacterial genera in rainbow trout during refrigeration

水產品中有多種微生物存在，但只有其中部分會導致腐敗變質[34]。虹鱒魚片貯藏中后期的優(yōu)勢菌為假單胞菌屬。CK組貯藏4 d時假單胞菌屬占比85.6%，貯藏8 d占比98.4%；GTP組貯藏6 d假單胞菌屬占比99.8%；CS組貯藏6 d假單胞菌屬占比84.6%，顯著低于GTP組，并低于CK組貯藏8 d的占比，說明殼聚糖對優(yōu)勢腐敗菌假單胞菌屬的抑制作用優(yōu)于茶多酚。MIX組貯藏8 d的優(yōu)勢菌假單胞菌屬占比75.9%，顯著低于CK組的98.4%，說明茶多酚和殼聚糖的復配保鮮劑有較好的抑制假單胞菌屬生長繁殖的作用。在貯藏末期，GTP組、CS組貯藏10 d和MIX組貯藏13 d，假單胞菌屬占據顯著優(yōu)勢。結合Wang Hang等[35]針對草魚的實驗，該研究表明，假單胞菌屬與魚肉腐敗直接相關，是典型的低溫腐敗菌，具有很強的蛋白質和脂肪分解能力[36]，可以判斷假單胞菌屬為貯藏虹鱒魚片的特定腐敗菌。因此，茶多酚和殼聚糖的復配生物保鮮劑可以通過改變魚片菌群組成，尤其是抑制假單胞菌屬來減緩魚片品質劣變，進而延長生鮮魚片的 貨架期。

3 結 論

茶多酚和殼聚糖復配保鮮劑的涂膜處理是一種有效延長虹鱒魚貨架期的保鮮方法，具有作為良好天然防腐劑的潛力。涂膜處理抑制了魚片中菌落總數的增長，延緩感官評分下降和TVB-N含量增長。結合多個指標，復配保鮮劑涂膜處理將4 ℃貯藏虹鱒魚片的貨架期延長約5 d。茶多酚和殼聚糖單獨處理也有一定抑菌效果，但復配保鮮劑效果更佳。可能由于茶多酚和殼聚糖分別存在有效的生物活性成分和天然抗菌劑，復配保鮮劑具備更廣泛的抗菌譜，抑菌覆蓋面更寬，具有協(xié)同增效作用。新鮮虹鱒魚的菌群由16 個菌屬組成，其中考克氏菌屬和假單胞菌屬為新鮮虹鱒魚的優(yōu)勢菌屬，假單胞菌屬隨貯藏時間延長不斷占據優(yōu)勢，成為虹鱒魚的優(yōu)勢腐敗菌，殼聚糖和茶多酚復配保鮮劑可能通過抑制假單胞菌屬生長而減緩腐敗過程。本研究為虹鱒魚品質控制技術提供了理論參考。