不同發酵劑對兔肉脯食用品質的影響

柴利，賀稚非,2，廖林，謝兆華，韓薇，李洪軍,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400715)

兔肉富含多不飽和脂肪酸、蛋白質和必需氨基酸，且脂肪、膽固醇和過敏源含量較少[1]，現已逐漸成為國民飲食結構中的理想肉食。近年來，受非洲豬瘟以及新冠疫情的影響，國內外兔肉產業的發展受到了一定的影響，但并沒有改變兔肉產量穩步上升的趨勢[2]。目前，國內外市場上的兔肉主要以冷鮮肉為主，兔肉產品也主要是麻辣兔頭、冷吃兔和手撕兔等傳統烹飪產品，并且現有的兔肉加工產品普遍存在易受微生物污染、保質期短、需要冷藏保存、質量參差不齊和深加工程度低等問題，這極大的阻礙了兔肉產業的進一步發展。

肉脯是一種味道鮮美、芳香濃郁、食用方便、耐貯藏、便于運輸的休閑干肉制品。目前，市面上的肉脯主要是以傳統工藝生產的豬肉脯和牛肉脯為主，普遍存在風味單一、質地干硬和顏色差等問題[3]，難以滿足消費者的需求。在傳統的肉脯制作工藝中引入微生物發酵技術，既能為肉脯帶來特殊的風味、改善肉脯干硬、不易咀嚼等缺點，還能進一步延長肉脯的貯藏期[4]。例如，樊明明[5]用植物乳桿菌、肉葡萄球菌和戊糖片球菌對豬肉脯進行發酵，發現發酵豬肉脯在口感滋味、風味、色澤和硬度上均得到改善。高靜等[6]用植物乳桿菌和釀酒酵母為復合發酵劑發酵豬肉脯，發現發酵可顯著提升豬肉脯的風味。ZHAO等[7]用保加利乳桿菌生產發酵豬肉脯也得到了類似的結果。彭健斌[3]用植物乳桿菌、肉葡萄球菌和戊糖片球菌混合發酵劑制得的羊肉脯在感官、色澤、質構特性、揮發性風味物質種類、羊肉脯膻味物質的降解和貨架期等方面均優于對照組。然而，關于發酵兔肉脯的研究還較少，主要集中于發酵劑對兔肉脯的游離氨基酸含量[8]和游離脂肪酸含量[9]的影響。

常用于肉制品發酵的菌株有乳酸菌、葡萄球菌、微球菌、酵母和霉菌[6]，本實驗中采用的發酵劑分別為LHP DRY(戊糖片球菌、乳酸片球菌)、B-LC-78(乳酸片球菌、肉葡萄球菌)、CS-300(肉葡萄球菌、肉葡萄球菌亞種)和EasyCure LC(漢斯德巴氏酵母菌、彎曲酵母菌、肉葡萄球菌和小牛葡萄球菌)型商業發酵劑。乳酸菌在發酵肉制品中能改善風味、促進消化吸收和抑制雜菌生長繁殖[10]。葡萄球菌和微球菌能促進發酵肉制品中特殊發酵風味的形成[11]并抑制產品褪色和異味生成[12]，但是其產酸性能較弱，實際生產中常與乳酸菌混合使用。酵母菌主要生長在產品表面或淺表層，通常與其他菌種混合使用，具有穩定產品色澤，增強香味的作用[13]。因此，本文以雄性伊拉兔為原料，經斬拌、腌制、發酵、抹片、烘干、熟化和壓片等工藝制成發酵兔肉脯，并在發酵階段分別接種LHP DRY、B-LC-78、CS-300和EasyCure LC型商業發酵劑，通過對產品進行感官評定和一系列理化指標的測定，篩選出一種最適合用于發酵兔肉脯的商業發酵劑，以期為發酵兔肉脯的生產提供理論依據，同時為拓寬兔肉深加工產品領域和助力兔肉產業綠色發展作出一定貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從重慶阿興記良種選育基地挑選70～75日齡雄性伊拉兔(1.5～1.7 kg)，按照國家畜禽屠宰加工衛生規范宰殺兔子，去除皮、頭、內臟和骨后立即放入裝有冰袋的冷藏箱(6 ℃左右)運送到實驗室，再將兔肉于4 ℃排酸處理24 h，于-18 ℃凍藏備用。

發酵劑(LHP DRY、B-LC-78、CS-300、EasyCure LC)，科漢森股份有限公司；白砂糖、食鹽、雞蛋、味精、十三香、姜蔥料酒、魚露，重慶永輝超市；乙基麥芽酚、復合磷酸鹽、紅曲紅、D-異抗壞血酸鈉、瓜爾豆膠、大豆分離蛋白，河南萬邦化工科技有限公司；氯化鉀、25%(體積分數)戊二醛、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水乙醇、氯化鈉、高氯酸、氫氧化鈉，重慶躍翔化工有限公司。

1.2 儀器與設備

FA214A型電子分析天平，上海豪晟科學儀器有限公司；PB-10型酸度計，賽多利斯科學儀器有限公司；Ultra-Scan PRO型測色儀，美國Hunter Lab公司；Avanti J-301型冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特公司；TA.Plus型質構儀，英國stable micro system公司；SCIENTZ-12 N型真空冷凍干燥機、XHF-D型均質機，新芝生物科技股份有限公司；Phenom Pro型掃描電鏡，Phenom World；L-8900型全自動氨基酸分析儀，日本日立公司；cNose型電子鼻，上海保圣實業發展有限公司；RXZ-800B型人工氣候箱，寧波東南儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

1.3.1.1 工藝流程

兔肉脯制備工藝流程如下：

原料肉處理→斬拌、腌制→發酵→抹片→烘干→熟化、壓片、切片→冷卻→包裝

1.3.1.2 操作要點

原料肉處理：實驗前12 h將兔肉取出放于4 ℃人工氣候箱解凍，解凍后除去肉眼可見的筋膜和淤血等，切成小塊。

斬拌、腌制：依照兔肉質量加入白砂糖11%，食鹽1%，全蛋液5%，味精0.25%，乙基麥芽酚0.3%，復合磷酸鹽0.3%，十三香0.2%，紅曲紅0.04%，D-異抗壞血酸鈉0.05%，姜蔥料酒1%，魚露6%，瓜爾豆膠0.3%，大豆分離蛋白3%，葡萄糖2%，混合均勻后再用斬拌機斬拌4 min，于4 ℃腌制2 h。

發酵：按發酵劑添加量加入發酵劑，25 ℃恒溫恒濕培養箱中發酵24 h。

抹片：先在洗凈烘干的瓷盤表面刷一層植物油，再將肉糜抹到瓷盤上，用抹刀打平整，厚度為2～3 mm。

烘干：將烘箱預熱至65 ℃，再將抹片的瓷盤放入，控溫在65 ℃烘5 h，烘干期間每隔30 min翻1次。

熟化、壓片和切片：將烘干后的肉鋪放入烘箱中于150 ℃熟化2 min，趁熱壓片，然后切成4 cm×6 cm的片狀。待自然冷卻后用PET/PE真空包裝袋包裝。

上述工藝參數及配方由前期單因素試驗得出。

1.3.2 實驗設計

實驗分為5組，不添加發酵劑的為對照組(control check, CK)，添加不同發酵劑的為實驗組，具體見表1。

表1 實驗設計表

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 水分含量的測定

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》中的直接干燥法進行測定。

1.3.3.2 pH值的測定

參考劉悅[2]的方法，稍作修改。稱取3 g剪碎的樣品，加入30 mL 0.1 mol/L的KCl溶液，以4 700 r/min均質60 s，隨后用pH計測定，待讀數穩定后計數，每個樣品測3次，取平均值。測定前對pH計進行校準，25 ℃，校準緩沖液pH 4.00、pH 6.88。

1.3.3.3 色差的測定

使用Ultra-San PRO測色儀測定兔肉脯的L*、a*和b*值，檢測前依次用黑板、白板校正，每組測3次，取平均值。

1.3.3.4 剪切力的測定

參考李培紅[14]的方法，稍作修改。使用質構儀測定兔肉脯的剪切力，測定前將兔肉脯制成2 cm×2 cm的正方形。測定相關參數：采用A/MORS探頭，測前速度1 mm/s，測試速度2 mm/s，測后速度10 mm/s，剪切率90%，感應力10 g。平行測定3次，取平均值。

1.3.3.5 質構特性的測定

參考KARGOZARI等[15]的方法，稍作修改。將肉脯制成2 cm×2 cm的正方形，分別測定樣品的硬度、彈性和咀嚼性，每組重復3次。參數設置：測前速度1 mm/s，測試速度1 mm/s，測后速度1 mm/s，探頭上升高度25 mm，壓縮比25%，觸發力5 g，間隔時間5 s，選用P/36R探頭。

1.3.3.6 微觀結構的測定

參考王夢琦等[16]的方法，稍作修改。將肉脯剪成0.5 cm×0.5 cm，并在4 ℃下于含有15 mL 2.5%戊二醛的磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L, pH 7.2)中固定24 h。將固定后的樣品用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次15 min；依次用30%、50%、70%、90%和100%(體積分數)乙醇溶液脫水，每次1 h；再將樣品用真空冷凍干燥機干燥24 h，然后將干燥的樣品進行噴金鍍膜，并通過掃描電子顯微鏡觀察微觀結構。

1.3.3.7 游離氨基酸的測定

參考付娜等[17]的方法，稍作修改。精確稱取剪碎的兔肉脯2.50 g，加入10 mL 3.5%(體積分數)高氯酸溶液，4 700 r/min均質60 s，均質后離心(10 000×g，10 min，4 ℃)，離心后取上清液；用適量高氯酸溶液洗滌沉淀物再次離心，合并兩次上清液并用1%或5%(質量分數)氫氧化鈉溶液調節pH值至2.0，用純水定容至25 mL。取1.5 mL過0.22 μm濾膜后用全自動氨基酸分析儀檢測。

滋味活度值(taste activity value，TAV)的計算如公式(1)所示：

(1)

1.3.3.8 電子鼻的測定

參考王強等[18]的方法，稍作修改。精確稱取剪碎的兔肉脯2.00 g置于25 mL頂空瓶中，于55 ℃水浴加熱30 min，冷卻至室溫后進行測定。主要實驗參數：清洗時間60 s，測試時間90 s，氣體流速1 L/min。

實驗所用的電子鼻由10個傳感器組成，電子鼻的傳感器對多種氣味都有強烈的響應值，具體如表2所示。

表2 電子鼻傳感器敏感物質

1.3.3.9 感官評價

參考GB/T 12315—2008《感官分析 方法學 排序法》進行感官評價。感官評定小組由8名食品專業的學生組成，并統一進行感官評價專業培訓。小組成員對5組兔肉脯的組織狀態、色澤、氣味和口感滋味依照喜好程度按5～1進行排序，分值越高代表越喜歡。感官評定標準見表3。

表3 感官評分標準

1.4 數據統計分析

采用SPSS 23軟件進行單因素方差分析和聚類分析，顯著性分析采用Duncan檢驗法，實驗結果表示為平均值±標準偏差，P<0.05表示具有顯著性差異，使用Origin 2018軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同發酵劑對兔肉脯水分含量和pH值的影響

由圖1可知，5組兔肉脯的水分含量均滿足GB/T 31406—2015《肉脯》的要求(≤20 g/100g)，且除B組外，其他實驗組的水分含量顯著低于對照組(P<0.05)，其中D組的水分含量降低至14.41 g/100g。同時，由于發酵劑中的微生物發酵產酸，故實驗組的兔肉脯pH值顯著降低(P<0.05)。低pH環境不僅可以抑制病原菌和腐敗菌的生長繁殖，還提高了產品的微生物安全性[7]。此外，pH值的降低也會導致蛋白質變性，肉的保水性下降[19]，從而使得兔肉脯的水分含量降低。

圖1 不同發酵劑對兔肉脯水分含量和pH值的影響

2.2 不同發酵劑對兔肉脯色差的影響

由圖2、圖3可知，發酵劑的加入對兔肉脯的L*值和b*值影響不大，但實驗組的a*值顯著高于對照組(P<0.05)，5組兔肉脯按a*值從大到小排序依次為C組>D組>A組>B組>CK組，說明發酵劑的加入能夠改善發酵兔肉脯的色澤，使其顏色更鮮艷。這可能是由于發酵劑中的微生物能夠將高鐵肌紅蛋白轉化為氧合肌紅蛋白或亞硝基肌紅蛋白，從而起到呈色效果[20]。

高管是企業管理的高級人才，一般指企業副總以上的人才，包括高級技術人才。高管是企業的核心人力因素。發揮高管的責任意識是提升企業發展的關鍵因素。

圖2 不同發酵劑對兔肉脯色差的影響

a-CK組；b-A組；c-B組；d-C組；e-D組

2.3 不同發酵劑對兔肉脯剪切力和質構特性的影響

嫩度通常是評價肉及肉制品的重要品質指標，剪切力越小，肉的嫩度越好。由圖4可知，發酵劑的加入對兔肉脯的剪切力有顯著的影響(P<0.05)，各組剪切力由大到小排序依次為CK組>D組>C組>A組>B組，其中B組的剪切力降至52.82 N，與對照組相比下降了66.9%，表明發酵兔肉脯的嫩度得到了改善。

圖4 不同發酵劑對兔肉脯剪切力的影響

由表4可知，5組兔肉脯在彈性上沒有顯著差異(P>0.05)，但是A、B、C 3組兔肉脯的硬度和咀嚼性顯著降低(P<0.05)，使肉脯更易咀嚼和吞咽。實驗組的剪切力、硬度和咀嚼性顯著降低可能是因為在發酵過程中肉葡萄球菌、小牛葡萄球菌和戊糖片球菌分泌的蛋白酶使兔肉的肌原纖維蛋白和肌漿蛋白發生不同程度的降解，破壞了肌原纖維的結構[21]，從而使得兔肉脯的硬度、咀嚼性和剪切力變小。綜上，發酵劑可以提高兔肉脯的嫩度，并且使兔肉脯的硬度和咀嚼性也降低，改善了傳統肉脯干硬、不易咀嚼的缺點。

表4 不同發酵劑對兔肉脯質構特性的影響

2.4 不同發酵劑對兔肉脯微觀結構的影響

由圖5可知，對照組的兔肉脯肌纖維較光滑，加入發酵劑后對兔肉脯的肌肉結構破壞嚴重，肌原纖維的連接發生崩解，呈碎片化。這主要是因為發酵劑中的肉葡萄球菌、乳酸片球菌和戊糖片球菌在發酵過程中能夠在兔肉脯內部和表面生長，并且分泌分解脂肪和蛋白質的脂肪酶和蛋白酶，從而使兔肉脯呈現圖5-b～圖5-d所示的肌原纖維小片化和斷裂的現象，這與彭健斌[3]在羊肉脯中添加肉葡萄球菌、戊糖片球菌和植物乳桿菌進行發酵的研究結果類似。掃描電鏡的結果也進一步表明了發酵劑能夠改變兔肉的肌肉結構，從而使兔肉脯的剪切力和硬度降低。

a-CK組；b-A組；c-B組；d-C組；e-D組

2.5 不同發酵劑對兔肉脯游離氨基酸的影響

2.5.1 不同發酵劑對兔肉脯游離氨基酸組成的影響

兔肉中的蛋白質在發酵過程中產生的各種肽類和游離氨基酸是兔肉脯產生特色風味的前體物質。由表5可知，5種兔肉脯都含有14種游離氨基酸，6種人體所必需的氨基酸；根據總游離氨基的含量多少排序依次為B組>D組>A組>C組>CK組，其中B組顯著高于其他4組(P<0.05)，這表明B組的乳酸片球菌和肉葡萄球菌對兔肉蛋白質的水解能力要強于其他組。從表5中還可以看出，各組谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸的含量都非常豐富，表明這些氨基酸是兔肉脯中主要的呈味物質；此外，實驗組兔肉脯中的絲氨酸、甘氨酸、異亮氨酸和精氨酸的含量與未發酵的兔肉脯相比都有所增加。綜上，微生物發酵劑可以提高兔肉脯中游離氨基酸的總量(P<0.05)，使兔肉脯的風味更加豐富。

表5 不同發酵劑對兔肉脯游離氨基酸的影響 單位：mg/100g

2.5.2 不同發酵劑對兔肉脯游離氨基酸味覺特征及TAV的影響

不同游離氨基酸的呈味閾值不同，故游離氨基酸的含量并不能用來評價對滋味的貢獻度。一般用游離氨基酸的風味強度值(TAV)來評價游離氨基酸對滋味的貢獻程度，當某種游離氨基酸的TAV>1時，則認為該物質對滋味有貢獻，并且TAV越大，滋味貢獻越高[22]。由表6可知，5組兔肉脯的總鮮味氨基酸最多，苦味氨基酸次之，甜味氨基酸最少；并且只有谷氨酸(鮮味)和丙氨酸(甜味)的TAV>1，其中谷氨酸的TAV達到14.61～16.32，丙氨酸的TAV達到1.02～1.20，是所有氨基酸中TAV最大的兩種，說明兔肉脯的整體風味為鮮甜味，具體見圖6。雖然各組都含有較多的苦味氨基酸，但LIOE等[23]研究發現，當苦味氨基酸的TAV<1時，對其他氨基酸的鮮味和甜味有增強作用。此外，實驗組的鮮、甜和苦味TAV總和均大于對照組，其中B組總體的鮮味和甜味TAV最大，進一步表明發酵劑能夠促進兔肉脯滋味物質的生成，尤其是B組的乳酸片球菌和肉葡糖球菌對促進發酵兔肉脯中呈味游離氨基酸的富集效果顯著。

表6 不同發酵劑對兔肉脯游離氨基酸味覺特征及TAV

圖6 不同發酵劑對兔肉脯呈味氨基酸總量組成模式分析

2.6 添加不同發酵劑對兔肉脯風味的影響

2.6.1 電子鼻分析

電子鼻是一種旨在模仿人類嗅覺感知的設備，它由一系列傳感器組成，用于檢測復雜的氣味[24]，并已在區分食品風味方面得到驗證[25]。由圖7可知，W3C、W1W和W2S 3個傳感器在各組均具有較高的響應值，表明氨、芳香類、無機硫化物、醇類、醛類和酮類是兔肉脯中的主要風味物質。對照組和實驗組的兔肉脯起到區別作用的傳感器有W1C、W5S、W6S、W5C、W1S，其中，對照組兔肉脯中的芳烴化合物和氮氧化合物響應值顯著高于實驗組(P<0.05)；添加發酵劑后，在氫化物、短鏈烷烴芳香成分和烷類的響應值增加(P>0.05)。綜合來看，B組和D組的發酵兔肉脯綜合響應值最高，風味物質最為豐富。

圖7 不同兔肉脯的電子鼻傳感器響應值雷達圖

2.6.2 聚類分析

聚類分析是一種研究分類問題的多元分析方法，已廣泛用于食品風味物質的評價[26]。本文采用組間連接法和歐氏距離，根據相似性對5組兔肉脯進行分類，結果用樹狀圖表示(圖8)。當歐式距離為10時，5個樣品可分為3類。其中，對照組為一類，A組為一類，剩余B、C、D組為一類，說明添加發酵劑對兔肉脯的風味有較大的影響，并且B、C、D組的發酵兔肉脯在風味上具有相似性，這可能是因為這3組發酵劑中都含有肉葡萄球菌，具有相似的脂肪酶和蛋白酶，從而分解蛋白質和脂肪產生相似的風味物質。

圖8 不同兔肉脯的聚類分析圖

2.7 五組兔肉脯感官評定的結果

對5組樣品進行排序檢驗，采用Friedman檢驗法計算樣品間是否存在顯著性差異，當品評員數j=8，樣品數p=5時，Friedman檢驗臨界值表見表7，并采用Kramer檢驗法進行排序。評價員感官評定結果如表8所示。

表7 Friedman檢驗臨界值

在組織狀態上，由表8可知j=8，p=5，R1=13.5，R2=16.5，R3=33.5，R4=30，R5=26.5，由Friedman檢驗公式：

表8 兔肉脯感官評定結果

式中：j為品評員人數；p為樣品數；Ri為第i個產品的秩和。

帶入得到Ftest=14.95>F0.01。同理，在色澤上，Ftest=9.8>F0.05；在氣味上，Ftest=10.33>F0.05；在口感滋味上，Ftest=13.23>F0.01。綜上，5組兔肉脯在組織狀態和口感滋味上，有極顯著差異(P<90.01)，在色澤和氣味上，有顯著差異(P<0.05)。

樣品之間可以根據差異程度進行分組，查Kramer檢驗表，得到檢驗表(α=0.05，α=0.01)中對應品評員數j=8，樣品數p=5的臨界值如表9所示。通過下段檢查樣品間的差異程度，如果排序秩和在下段區間范圍內可劃分為一組，如果排序秩和下段范圍的上限之外和下限之外的樣品可分別組成一組[27]。據表9可知，在α=0.01的顯著水平下，根據組織狀態各樣品可分為3組：CK，ADC，B，口感滋味可分為3組：D，CKAC，B，說明B組發酵劑中的乳酸片球菌和肉葡萄球菌能夠明顯的改善兔肉脯的組織狀態和口感滋味。在α=0.05的顯著水平下，根據色澤各樣品可分為2組：CK，ABCD，說明實驗組的微生物發酵劑都能較好的促進兔肉脯發色；根據氣味可分為2組：CK，DCAB，說明感官評定員對實驗組兔肉脯的氣味喜愛度要優對照組。綜合兔肉脯的組織狀態、口感滋味、色澤和氣味來看，B組發酵兔肉脯的綜合得分最高，說明B組的發酵兔肉脯更易被消費者接受。

表9 j=8，p=5時Kramer檢驗表上下限

3 結論

本文研究了4種商業發酵劑對兔肉脯食用品質的影響。研究結果表明，與對照組相比，實驗組發酵兔肉脯的水分含量為14.4%～15.5%，pH值為5.4～5.9，均低于對照組。從色差的測定結果可以看出，4種發酵劑對發酵兔肉脯都具有促進發色的作用。另外，發酵劑中的微生物可以破壞兔肉肌肉結構的完整性，從而使發酵兔肉脯的剪切力、硬度和咀嚼性均顯著降低。綜合來看，B組的發酵劑能夠最有效地改善兔肉脯的質地。從游離氨基酸和電子鼻測得的風味物質可以看出，經微生物發酵后的兔肉脯風味和滋味都更加豐富。其中，B組發酵劑能較大程度的促進滋味和風味物質的富集。綜合感官評分的結果可以看出，B組在組織狀態、氣味和口感滋味上都具有較高的喜愛度。因此，B組的肉葡萄球菌和乳酸片球菌可認為是4種商業發酵劑中制作發酵兔肉脯最佳的發酵劑，未來可進一步優化發酵工藝用于發酵兔肉脯的開發和生產。