殼寡糖復合固體飲料對高尿酸血癥小鼠的降尿酸作用研究

莊林，操俊，李月嬋，王佳麗，陳列歡，羅學剛,3*

1(天津科技大學 生物工程學院, 工業發酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業微生物重點實驗室，天津，300457)2(新優藍健康科技有限公司，廣東 廣州，510530)3(天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心，天津，300457)

高尿酸血癥指的是一種體內尿酸水平異常的代謝紊亂性疾病。造成尿酸水平異常的原因一般有2種，一種是嘌呤代謝紊亂造成的尿酸生成過多，另一種是尿酸在腎、肝排泄受到阻礙造成尿酸的沉積。當高尿酸血癥發展到一定程度造成尿酸在關節處堆積，進而發展成為痛風，同時引起多種炎癥的發生[1]。目前高尿酸與痛風的防治藥物主要有三類。一類是抑制尿酸生成類藥物，例如別嘌呤醇、非布司他等;一類是促進尿酸排泄類藥物，例如苯溴馬隆、丙磺舒等；還有一類是緩解痛風的消炎止痛類藥物秋水仙堿等。這些藥物在發揮作用的同時往往會對肝腎造成損傷，針對本身兼患肝病、腎病的患者更需要嚴格把控用量。除此之外，高尿酸血癥的防治離不開飲食干預，研究開發出能夠輔助治療高尿酸血癥與痛風的功能性食品十分必要[2]。

殼寡糖是由β-1-4糖苷鍵連接組成的堿性氨基低聚糖，一般通過降解殼聚糖獲得[3]。殼寡糖具有多種生物活性，例如：降脂、抗氧化、提高免疫力等，近年來被廣泛應用于食品、化妝品產業，并已被發現具有降低酵母聯合嘌呤致高尿酸血癥小鼠的血清尿酸的作用[4-5]。除此之外，在高尿酸血癥大鼠模型中，低劑量的櫻桃粉可以通過降低腺苷脫氨酶的活性緩解高尿酸血癥[6]。研究表明鵝肌肽與人參皂苷聯合可以促進高尿酸血癥小鼠尿酸排泄[7]。茯苓則被證實可以通過上調ABCG2的基因與蛋白表達調節高尿酸血癥[8]。在此基礎上，通過一定比例優化制成了由4種主要活性成分組成的殼寡糖復合固體飲料“殼酸平”(ke suan ping，KSP)。

尿酸轉運蛋白1(urate transporter 1，URAT1)、葡萄糖轉運蛋白9(glucose transporter type 9，GLUT9)是尿酸排泄過程中的關鍵轉運蛋白。ATP結合盒亞家族G成員2(ATP-binding cassette sub-family G member 2，ABCG2)是與尿酸排泄有關的蛋白編碼基因。研究表明高尿酸血癥患者URAT1、GLUT9表達異常升高，可以通過抑制其表達緩解高尿酸血癥[9]。ABCG2表達異常降低，可以通過上調其表達促進尿酸排泄[10],且部分原發性高尿酸血癥患者其URAT1、GLUT9、ABCG2等的表達可能存在異常[11]。本文將通過探究殼寡糖復合固體飲料KSP對高尿酸血癥的影響，為高尿酸血癥及痛風的防治提供新的食源性方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

別嘌呤醇，上海麥克林生化科技有限公司；酵母膏，北京索萊寶科技有限公司；殼寡糖復合固體飲料(殼酸平)，新優藍健康科技有限公司；氧嗪酸鉀，阿拉丁試劑上海有限公司；尿酸、肌酐、尿素氮、黃嘌呤氧化酶(xanthione oxidase，XOD)活性檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；KM小鼠，(20±2) g，SPF級雄性，中國食品藥品檢定研究院(大興)；多聚甲醛，分析純，天津市江天化工技術有限公司；Trizol試劑，美國Ambion公司；M-MLV逆轉試劑，美國Promega公司；SYBR Green試劑，德國DBI Bioscience公司。

1.2 儀器與設備

85-2型恒溫磁力攪拌器，天津市華儀鑫達儀表有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海一恒科技有限公司；H1650-W臺式微量高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；Legend Micro 17R Thermo離心機，賽默飛世爾科技公司；UV mini-1240紫外分光光度計，日本SHIMADZU(島津)公司；SpecturaMax190全波長酶標儀，美國分子儀器公司；TP-24組織勻漿儀，杰靈儀器制造(天津)有限公司；BSA223S電子天平，德國賽多利斯(Sartorius)公司；ND-100C核酸定量儀，杭州米歐(MIULAB)儀器有限公司；BX53 正置熒光顯微鏡，日本Olympus公司；Stepone Plus實時熒光定量PCR儀，美國ABI公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠實驗

60只昆明小鼠隨機分為6組，每組10只，包括陰性對照組(negative group，NC)、高尿酸模型組(model group，M)、低劑量殼酸平組(low-dose KSP group，LKSP)、中劑量殼酸平組(middle-dose KSP group，MKSP)、高劑量殼酸平組(high-dose KSP group，HKSP)、別嘌呤醇組(allopurinol group，AP)。適應性喂養1周，飼養條件為：(24±2) ℃，12 h光照，12 h黑暗，自由攝食與飲水。正式實驗開始后將LKSP、MKSP、HKSP組小鼠飼料更換為含1.6%、2.6%、3.6% KSP的飼料，對應活性成分殼寡糖的含量為150、250、350 mg/(kg·d)。除NC組小鼠，其余小鼠每天腹腔注射300 mg/kg氧嗪酸鉀，同時灌胃10 g/kg酵母膏。1 h后AP組小鼠灌胃30 mg/kg別嘌呤醇，M組灌胃對應的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)。實驗周期為21 d，所有小鼠自由飲水，除KSP組小鼠均正常飲食。最后一天摘眼球取血后，脫臼斷頸處死小鼠。解剖取小鼠肝、腎、小腸置于液氮速凍。取部分肝腎組織生理鹽水清洗后，置于10%多聚甲醛溶液固定。所有動物實驗操作嚴格遵守實驗倫理有關原則和要求。

1.3.2 血清理化指標檢測

血液樣品室溫3 000 r/min離心15 min，吸取上清液置于4 ℃備用，按照尿酸、肌酐、尿素氮、XOD活性檢測試劑盒說明書分別進行測定。

1.3.3 HE染色

固定好的肝腎組織經過PBS充分清洗后，使用梯度乙醇浸泡脫水，二甲苯透明。利用石蠟包埋組織，待石蠟冷卻后切片，切片厚度4 μm。水浴展片后固定在載玻片上，烤片后進行HE染色。利用正置熒光顯微鏡放大10倍觀察。

1.3.4 q-PCR

剪取適量小鼠組織，預冷研缽，加入1 mL Trizol研磨，收集至1.5 mL EP管內。或者直接置于1.5 mL EP管加入1 mL Trizol利用組織勻漿儀研磨。研磨后加入預冷的200 μL三氯甲烷冰上靜置5 min，4 ℃ 12 500 r/min離心12 min。收集上清液加入等體積的異丙醇-20 ℃靜置1 h后，再次離心，棄上清液。加入75%(體積分數)乙醇再次離心，待乙醇揮發后加入焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水溶解定量。按照逆轉錄試劑說明書將RNA逆轉為cDNA。逆轉體系為25 μL，包括RNA 2 μg、隨機引物5 μL、dNTP 5 μL、M-Mlv RT 1 μL、M-Mlv 5×buffer 5 μL、RNA inhibitor 0.625 μL，其余用DEPC水補足。按SYBR Green試劑說明書配制20 μL PCR反應體系，包括DEPC水7.6 μL、SYBR Green Master Mix 10 μL、ROX 0.4 μL、引物1 μL(上下游引物各0.5 μL)、cDNA模板1 μL。q-PCR條件為：保持階段(95 ℃ 2 min)、循環階段(95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s)、溶解曲線階段(95 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s 階升0.3 ℃)、循環數40個。內參基因為GAPDH，算法為2-ΔΔCT，特異性引物序列如表1所示。

表1 q-PCR特異性引物序列

1.4 數據統計

實驗數據利用Graph Pad Prism 5.0進行處理。結果表示為Mean±SD，采用One-Way ANOVA進行組間差異分析，當P<0.05時表示為“*”、當P<0.01時表示為“**”、當P<0.001時表示為“***”，且當P<0.05時就認為存在統計學差異。

2 結果與分析

2.1 KSP可降低高尿酸血癥小鼠血清中尿酸及XOD活性

如圖1-a所示，與NC組相比，M組小鼠血清中尿酸(uric acid，UA)含量顯著升高(P<0.001)。與M組相比，HKSP組的UA含量顯著降低(P<0.01)，AP組也顯著降低(P<0.001)。與NC組相比，LKSP組與MKSP組的UA含量均顯著升高，但差異逐漸減小，HKSP組的UA與NC組無顯著差異。此結果顯示KSP可以顯著降低UA。

XOD可以催化次黃嘌呤轉化為黃嘌呤，同時可以催化黃嘌呤直接產生尿酸，是尿酸生成的關鍵酶[12]。如圖1-b所示，與NC組相比，M組血清XOD酶活顯著升高(P<0.001)。與M組相比，HKSP組XOD酶活顯著降低(P<0.01)，AP組XOD酶活極顯著降低(P<0.001)。與NC組相比，HKSP組XOD酶活顯著升高(P<0.001)。此結果顯示，KSP可以使高尿酸血癥小鼠異常升高的XOD酶活得以降低，但不能使其恢復到正常水平。二者結果結合來看，KSP可以通過降低XOD酶活發揮降尿酸作用。

a-血清尿酸；b-血清XOD活性

2.2 KSP可緩解高尿酸血癥小鼠肝腎損傷

當腎功能不全，腎小球的濾過功能異常時，血清尿素氮(urine urea nitrogen，BUN)會異常上升。如圖2-a所示，相比于NC組，M組血清BUN含量顯著升高(P<0.001)。相比于M組，LKSP、MKSP組血清BUN含量沒有明顯變化，HKSP組血清BUN顯著升高(P<0.05)，AP組血清BUN極顯著升高(P<0.001)。除此之外，相比于NC組，LKSP組血清BUN含量仍顯著升高(P<0.05)。此結果說明了高劑量的KSP不能改善腎功能異常，低劑量的KSP雖然有一定效果但是也不能完全減低由高尿酸血癥引起的血清BUN含量異常。

血清肌酐(creatinine，CR)經腎小球濾過以后完全進入原尿，不會被腎小管重吸收，因此血清CR也是評價腎功能異常的指標。如圖2-b所示，相比于NC組，M組血清CR顯著升高(P<0.01)，HKSP組血清CR極顯著降低(P<0.001)，且隨著KSP的劑量加大血清CR降低。相比于NC組，LKSP組血清CR仍顯著升高(P<0.01)，AP組血清CR極顯著升高(P<0.001)，甚至比M組更顯著。此結果顯示，KSP可以加強腎小管的濾過作用，促進血清CR的排泄。

a-血清尿酸氮；b-血清肌酐

肝臟HE染色結果如圖3所示。由圖3可知，NC組小鼠肝板細胞排列緊密，肝小葉結構清晰。相比于NC組，M組肝板細胞體積變小，部分細胞核消失，細胞質溶解，從整體來看肝竇無規律性擴張，肝索結構被破壞。相比于M組，KSP處理組均有一定改善，HKSP組效果較好。AP組肝組織HE染色結果與M組無明顯差異，細胞松散排列，肝竇粗且部分區域肝索消失。此結果證明KSP可以緩解高尿酸血癥引起的肝臟損傷。

a-陰性對照組；b-模型組；c-低劑量KSP組；d-中劑量KSP組；e-高劑量KSP組；f-別嘌呤醇陽性對照組

腎臟HE染色結果如圖4所示。NC組細胞呈圓形，大小均一，排列緊密。相比于NC組，M組腎細胞形態發生巨大變化，部分細胞伸長，部分細胞體積變小，整體排列無規律，且部分細胞細胞膜消失，完全壞死。相比于M組，隨著KSP劑量增加，腎細胞形態趨于正常。MKSP與HKSP效果顯著。與M組相比，AP組細胞大面積壞死，壞死組織周圍存在大量炎細胞。腎臟HE染色結果顯示KSP可以緩解高尿酸血癥引起的腎臟損傷，AP進一步加劇了這種腎損傷。

a-陰性對照組；b-模型組；c-低劑量KSP組；d-中劑量KSP組；e-高劑量KSP組；f-別嘌呤醇陽性對照組

2.3 KSP的降尿酸作用與抑制URAT1/GLUT9基因表達有關

URAT1的q-PCR結果如圖5-a所示，相比于NC組，M組URAT1的 RNA水平顯著升高(P<0.05)。相比于M組，LKSP組URAT1的 RNA水平顯著降低(P<0.01)，MKSP、HKSP組與LKSP組沒有明顯差異，均能顯著降低URAT1的RNA水平。相比于NC組，MKSP組URAT1的RNA水平與NC組也存在顯著性差異(P<0.05)。GLUT9的q-PCR結果如圖5-b所示，相比于NC組，M組GLUT9的RNA水平顯著升高(P<0.001)。相比于M組，HKSP組的RNA水平顯著降低(P<0.001)。LKSP、MKSP組GLUT9的表達水平也有所下降，但差異沒有HKSP組明顯，并且與NC組相比，仍顯著升高，但這種差異隨著KSP的劑量增加而減小。ABCG2的q-PCR結果如圖5-c所示，相比于NC組，M組ABCG2的表達水平下降，但無顯著性差異。與M組相比，KSP處理組ABCG2的表達水平均沒有顯著變化，MKSP、HKSP組ABCG2的表達水平有上升趨勢，但無顯著差異。但由圖5可知，與NC組相比，MKSP、HKSP的ABCG2的表達水平也沒有顯著差異。總而言之，由圖5可知，KSP可以調節URAT1、GLUT9、ABCG2的RNA水平，使其恢復到正常水平。

a-URAT1 mRNA表達水平；b-GLUT9 mRNA表達水平；c-ABCG2 mRNA表達水平

3 討論與結論

研究表明菊粉(9.5 g/kg)可以降低尿酸酶(urate oxidase，UOX)敲除小鼠體內XOD的活性[13]；黃芩素(200 mg/kg)可以通過抑制XOD和促進尿酸排泄治療高尿酸血癥[14]；咖啡酰奎寧酸可以與XOD產生相互作用從而緩解高尿酸血癥[15]。嘌呤代謝紊亂造成UA生成異常，通過抑制XOD可以抑制黃嘌呤轉化為UA從而緩解高尿酸血癥。在本研究中，KSP同樣可以通過抑制XOD活性緩解高尿酸血癥，這為KSP發揮降尿酸作用的具體途徑研究提供了支持。

肝損傷促進肝功能的衰竭，炎癥可誘導急性或者慢性肝功能衰竭[16]。高尿酸血癥發展為痛風會伴隨著炎癥的發生。研究表明芹菜醇通過抑制NLRP3炎癥小體的激活可以減輕脂多糖誘導的肝損傷與尿酸鈉誘導的痛風性關節炎[17]。這說明肝損傷與炎癥具有密切聯系[18-19]。在本研究中，高尿酸血癥小鼠肝損傷嚴重，AP組無法對肝臟損傷起到緩解作用。KSP可以緩解由于高尿酸血癥造成的肝損傷，這在一定程度上證明了KSP可能會通過緩解肝損傷抑制炎癥的發生進一步降低高尿酸血癥發展為痛風的可能。除此之外，大約2/3的尿酸排泄依靠腎臟，腎功能損傷會進一步加劇高尿酸血癥[20]。KSP可以緩解腎臟損傷并進一步恢復血清BUN、CR至正常水平，這表明KSP可以在降尿酸的同時發揮維護腎功能的作用。

URAT1(SLC22A12)作為評價高尿酸血癥的標志性基因，其常見和罕見功能障礙變體顯著降低了痛風風險[21]。相比于M組，URAT1受KSP調節其表達水平下降。這表明KSP可以通過促進UA排泄緩解高尿酸血癥。然而，值得注意的是KSP處理組的URAT1 mRNA水平比NC組還要低。已有文獻表明：URAT1的轉錄表達主要會受到糖皮質激素受體、雌激素受體等核受體的調控[22-23]。此前已經發現殼寡糖可以抑制SMYD3的表達進而調控糖脂代謝紊亂[24]，而SMYD3則是糖皮質激素受體、雌激素受體重要的轉錄輔助因子[25-27]，高尿酸血癥與糖脂代謝紊亂也有著緊密的聯系[28]。因此，本研究推測KSP很可能是通過對SMYD3的調節從而影響了核受體對URAT1的轉錄調控。事實上，本研究也已經在實驗中檢測看到了KSP對SMYD3的轉錄抑制效應，后續也將對具體分子機制展開進一步的深入研究。

GLUT9以電原性和電壓依賴性的方式轉運尿酸鹽以維持UA的正常水平[29]。本研究中，GLUT9的表達同樣受KSP調節，其結果與多數降尿酸物質一致。例如白藜蘆醇(40 mg/kg)可以通過抑制GLUT9 mRNA與蛋白的表達降UA[30]，巖藻多糖(25 μg/mL)可以降低UA刺激的HK-2細胞中GLUT9、URAT1的表達[31]。相比于URAT1、GLUT9，ABCG2不僅在腎近端小管表達，也在小腸和肝臟的上皮細胞頂端膜表達，可以通過激活ABCG2增強腸道尿酸排泄[32]。KSP可增強ABCG2的表達調節高尿酸血癥，但沒有顯著性差異，其調節效果不如URAT1、GLUT9。

綜上所述，KSP可以發揮降尿酸作用，緩解高尿酸血癥帶來的肝腎損傷以及調節尿酸排泄相關轉運蛋白URAT1、GLUT9、ABCG2等的表達。但是KSP的調節作用也具有一定局限性。比如高劑量的KSP雖然降尿酸作用更為明顯，但是其對BUN的調節并沒有存在劑量依賴，低劑量的KSP就能顯著降低URAT1的表達，以及其對ABCG2的調節沒有顯著性差異，所以KSP的用量范圍仍然值得探究。盡管如此，KSP的應用價值不容忽視，其降尿酸作用以及對肝腎的保護作用為其應用于輔助治療高尿酸血癥與痛風提供了可能。