二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸聯合麥芽糊精對Ⅱ型糖尿病大鼠腸道菌群、有機酸及脂類分布的影響

蔣變玲，王維維，趙程洋，張東新，趙旭東，陳軍，彭磊，陳瓊，馮凡

(宿州學院 生物與食品工程學院，安徽 宿州, 234000)

Ⅱ型糖尿病是一種主要表現為胰島素抵抗或分泌不足而導致患者血糖顯著升高的慢性內分泌代謝疾病，患者各組織可因此受損，嚴重危害著居民健康并帶來沉重的醫療負擔[1]。

近年來ω-3系列多不飽和脂肪酸在Ⅱ型糖尿病方面的作用日益引起人們的重視[2]，其中源于海洋的二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)對Ⅱ型糖尿病的干預報道尚存在爭議。有研究表明攝入魚油的Ⅱ型糖尿病患者胰島素敏感性和空腹血糖水平無變化，但低密度脂蛋白膽固醇和血清甘油三酯水平上升[3-5]。而MOSTAD等[6]發現魚油會導致Ⅱ型糖尿病患者血糖上升，胰島素敏感性降低，增加脂肪組織中ω-3系列多不飽和脂肪酸含量。此外，抗性麥芽糊精作為一種新型的非黏性膳食纖維，有助于維持血液和脂質分布，由于對人體健康的有益作用而引起廣泛的關注[7]。LI等[8]研究發現，超重男性連續12周每日攝入 34 g抗性麥芽糊精可顯著降低體內所有葡萄糖標志物包括空腹血糖水平、糖化血紅蛋白及糖化血清白蛋白水平，并降低胰島素和胰島素抵抗，后兩者與ALIASGHARZADEH等[9]研究一致。據報道抗性麥芽糊精可顯著影響腸道菌群組成。BAER等[10]研究表明，每天攝入25～50 g抗性麥芽糊精可以呈劑量依賴性方式增加數種腸道菌的數量，如雙歧桿菌、擬桿菌、毛螺菌科、糞球菌和梭狀芽孢桿菌等。而機體腸道微生態變化與Ⅱ型糖尿病的發生發展密切相關[11-12]。

盡管在過去十年關于n-3不飽和脂肪酸的應用有了有效的經驗證據，但其在臨床上的使用或聯合使用(例如聯合益生菌、益生元、飲食/生活方式使用)在特定背景下預防和改善Ⅱ型糖尿病及其并發癥的效果方面目前證據尚不清晰且結果不一[13]，且對糖尿病患者腸道菌群的影響缺乏數據。因此，本文用EPA/DHA聯合麥芽糊精(maltodextrin,MED)飼喂糖尿病SD大鼠，檢測EPA/DHA和抗性麥芽糊精聯合使用對糖尿病大鼠空腹血糖、臟器指數及臟器脂類蓄積以及腸道菌群的影響，為EPA/DHA的聯合應用提供初步供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SD大鼠(SPF級)購于安徽醫科大學實驗動物中心(生產許可證scxk(皖)2017-001)。

1.2 實驗試劑

EPA、DHA聯合MED(含DHA 8.8%、EPA 12.5%和MED 70%，均為質量分數)，上海麥克林生化科技有限公司；鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)，Sigma-Aldrich生物公司；液相色譜所用流動相試劑、標準品(98%)等，上海麥克林生化科技有限公司。

1.3 儀器與設備

FA220 4B電子分析天平，上海佑科儀器儀表有限公司；高效液相色譜備有SPD-20A紫外可見檢測器，島津企業管理(中國)有限公司；ROCHE羅氏血糖儀(家用活力型)，羅氏診斷產品(上海)有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 Ⅱ型糖尿病大鼠模型的建立

10.0 mg/mL STZ溶液的配制參考克迎迎[14]的方法。各實驗組大鼠(3周齡)飼喂高脂高糖飼料，期間自由飲水。喂養28 d后，禁食12 h，模型組按40 mg/kg BW劑量腹腔注射STZ，正常對照組則注射等量檸檬酸鹽緩沖液。禁食12 h尾端采血測血糖，血糖值≥11.1 mmol/L即為造模成功。

1.4.2 動物分組及實驗設計

SD大鼠共30只，每組雌雄各半。分組為正常對照組(CK組，6只)，糖尿病組(STZ組)，MED低/中/高劑量組(分別記為MED 1/2/3組)，STZ和MED組每組選取造模成功的SD大鼠6只。MED 1/2/3組灌胃劑量分別為0.25、0.50、1.0 g/(kg·d)；STZ組和CK組灌胃生理鹽水，連續灌胃28 d，期間每天記錄各組大鼠體重、飲水量、空腹血糖等狀況。灌胃結束后乙醚麻醉大鼠并解剖，心臟取血用于血脂分析，摘取心、肝、脾、肺、腎器官稱重。無菌取結腸內糞便用于腸道菌群分析。

1.4.3 空腹血糖濃度測定

禁食不禁水12 h后尾靜脈取血，按羅氏測糖儀使用說明書檢測大鼠血糖。

1.4.4 臟器系數測定

將1.4.2所取得的各內臟器官稱重記錄，按公式(1)計算各臟器系數：

(1)

1.4.5 脂類分布測定

取0.3 g器官組織樣品，加3.0 mL氯仿甲醇溶液[V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶2]研磨2 min，加入1.0 mL的氯仿研磨30 s，加入1.0 mL水研磨30 s。吸取下層1.0 mL于EP管中，水浴揮干溶劑并烘干至恒重，稱取質量m2，按公式(2)計算各器官組織脂類蓄積量：

(2)

式中，mEP管為EP管的質量；m樣品為所取器官組織樣品的質量；n為稀釋倍數2。

1.4.6 腸道菌群16S rDNA擴增子測序及分析

該實驗委托天根生化科技有限公司。根據所擴增的16S區域特點，構建小片段文庫，基于Illumina測序平臺對該文庫進行雙末端測序，得到雙端測序reads。采用CTAB或十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)方法對樣本的基因組DNA進行提取，以稀釋后的基因組DNA為模板；根據測序區域的選擇，使用帶Barcode的特異引物進行PCR。PCR反應條件見表1。

表1 PCR反應條件

將1×loading buffer(含SYBR green)與PCR產物等量混合，在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。選擇主帶亮度在400～450 bp的樣品進行進一步實驗。根據PCR產物濃度進行等濃度混樣，并使用TIANgel Purification Kit (TIANGEN Biotech)進行純化，純化產物用于制備Illumina DNA文庫。使用TIANSeq快速DNA文庫構建試劑盒(illumina平臺)(TIANGEN Biotech)構建測序文庫，構建好的文庫經過Qubit定量和Agient2100文庫檢測，合格后，使用Illumina平臺進行PE250 bp測序，得到250 bp的雙端測序reads。通過對reads拼接過濾，序列去噪或者操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs)分組，并進行物種注釋及豐度分析，揭示樣品的物種構成，并進行各組間的比對考察受試物對SD大鼠腸道菌群的影響。

1.4.7 血液有機酸的測定

大鼠血液處理：200 μL血液與600 μL 0.7 mol/L偏磷酸混旋30 s。在-4 ℃冷卻沉淀10 min后，12 000×g離心15 min，過0.22 μm水系膜。

液相色譜條件：Ultimate AQ-C18上海月旭(Welch)液相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，檢測波長210 nm；柱溫25 ℃；流速0.7 mL/min；進樣體積20 μL。流動相A為10 mmol/L pH 2.5磷酸二氫鉀，流動相B為乙腈。丙酸、丁酸、正戊酸、異戊酸、新戊酸、酒石酸流動相條件為0～40 min，5% B；40～45 min，5%～30%；45～60 min，30% B；60～65 min, 30%～5% B；65～70 min, 5% B。

1.5 統計分析

各樣本檢測數據結果表示為平均值±標準偏差，利用SPSS進行單因素方差分析(IBM SPSS Statistics 20.0，Duncan test)。對測序原始數據進行拼接、過濾，得到有效數據，基于有效數據按照QIIME2 dada2分析流程或Vsearch的分析流程進行序列去噪或OTU聚類，隨后再進行物種分類分析。根據去噪或者聚類結果，對每個序列做物種注釋，對去重序列擴增子序列變體(amplicon sequence variants，ASVs)或OTUs進行豐度、Alpha多樣性等分析以得到樣本內物種豐富度/均勻度信息等，并比較不同樣品在物種多樣性方面的相似程度。擴增子的注釋結果還可以利用PICRUST軟件相應的功能數據庫相關聯，對其KEGG等數據庫進行相關分析。通過偏最小二乘判別分析(partial least-squares discrimination analysis,PLS-DA)探究不同樣本或組別間群落結構的差異。物種注釋部分利用R語言工具繪制成樣品各分類學水平下的群落結構圖。

2 結果與分析

2.1 MED對大鼠飲水量的影響

由圖1可知，STZ組大鼠飲水量明顯超過CK組，出現糖尿病的多飲癥狀。除第7天外，MED組大鼠飲水量均顯著低于STZ組(P<0.05)，說明MED灌胃可一定程度上緩解糖尿病所引起的多飲癥狀，但不同組別間無顯著差異(除第13天和第25天外，P<0.05)。

圖1 MED對SD大鼠水攝入量的影響

2.2 MED對大鼠空腹血糖的影響

由圖2可知，STZ組大鼠空腹血糖值明顯高于CK組，出現顯著高血糖癥狀(P<0.05)，說明造模成功。灌胃后MED組大鼠血糖雖有降低但仍>11.1 mmol/L。MED1和MED3組在灌胃前期短時間內對血糖升高有緩解趨勢，但后期效果不明顯；MED2組后期降血糖效果較其他MED劑量組好，但均無統計學意義。

圖2 MED對SD大鼠空腹血糖的影響

2.3 MED對大鼠臟器系數的影響

由圖3可知，大鼠注射STZ后各器官臟器系數均顯著或非顯著增高。臟器系數增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等。在灌胃MED后，各MED組對于糖尿病引起的肝臟系數和腎臟系數增大有一定的緩解作用。中劑量MED對于糖尿病導致的大鼠各器官臟器系數增大有一定的改善作用。康黎等[15]的實驗證明了EPA對于糖尿病引起的心臟臟器系數增大問題有所改善，張敏芳等[16]的實驗證明了EPA對于糖尿病引起的腎臟臟器系數增大問題有積極作用。

圖3 MED對SD大鼠臟器指數的影響

2.4 MED對大鼠脂類分布的影響

由圖4可知，STZ組的平均脂類蓄積量均高于或顯著高于CK組，可能是糖尿病引起大鼠體內脂質代謝紊亂有關[17]。MED組各器官脂類蓄積量均高于或顯著高于STZ組，且MED組各器官脂類蓄積量在脾臟、腎臟和肝臟中呈一定的劑量依賴性關系。MED不僅無法減緩糖尿病引起的脂質蓄積量增長，反而加劇了這種變化，這可能與MED中含有的ω-3系列不飽和脂肪酸EPA/DHA引起的脂類代謝紊亂有關[2]。

圖4 MED對SD大鼠脂分布的影響

2.5 MED對大鼠腸道菌群的影響

2.5.1 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性反映的是樣本內的微生物群落多樣性，通過對單個樣品的多樣性分析可以反映樣本內的物種豐度及物種多樣性。Alpha多樣性衡量指標有Chao1、Ace、Shannon、Simpson，見圖5。Chao1和Ace指數衡量物種豐度即物種數量的多少。Shannon和Simpson指數用于衡量物種多樣性，受樣品群落中物種豐度和物種均勻度的影響。相同物種豐度的情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，則認為群落具有越大的多樣性，Shannon指數和Simpson指數值越大，說明樣品的物種多樣性越高[18]。由圖5-a、圖5-b可知，和CK組相比，STZ組Chao1和Ace指數有降低，而MED2和MED3組可顯著提高該指數(P<0.05)，說明中高MED可改善糖尿病引起的腸道菌群物種數量的降低。由圖5-c可知，中高劑量MED可改善糖尿病引起的腸道菌群物種多樣性的降低(P<0.05)。

a-α多樣性分析Chao1指數；b-α多樣性分析Ace指數；c-α多樣性分析Shannon指數；d-α多樣性分析Simpson指數

2.5.2 物種注釋及相關分析

將所測得的序列與微生物參考數據庫來進行對比得到每個物種分類信息，生成不同分類水平上的物種豐度表，并繪制各處理組在屬水平的相對豐度柱形累加圖(圖6)，取豐度水平前10的菌屬統計。

圖6 屬水平上各組腸道菌群物種相對豐度柱形累加圖

STZ組與CK組相比，乳桿菌屬的相對豐度略有減少；雙歧桿菌屬的相對豐度有顯著增加(P<0.05)；Muribaculaceae的相對豐度明顯減少(P<0.05)。各MED組與STZ組相比，各處理實驗組雙歧桿菌屬的相對豐度都有較為顯著的減少(P<0.05)，因此認為MED可以有效改善糖尿病大鼠雙歧桿菌屬的相對豐度至正常水平。MED1和MED2組Muribaculaceae的相對豐度相較于STZ組有所增加，因此一定程度上改善糖尿病大鼠Muribaculaceae的相對豐度。

于斌等[19]通過與健康人群比對后發現糖尿病患者腸道雙歧桿菌屬顯著增加，乳酸桿菌屬顯著減少，且患者腸道內的菌群多樣性有降低趨勢，說明糖尿病會使得腸道菌群的種屬產生差異。李彩鳳[20]對多位糖尿病患者和同期相同數量的健康人員的腸道菌群變化進行研究，結果顯示，糖尿病組Muribaculaceae、乳酸桿菌數量則低于健康組。而本文亦發現糖尿病大鼠的Muribaculaceae和乳酸桿菌屬相對豐度低于健康組，該結論與本文所得結論一致。有研究表明腸道菌群失調和糖尿病的發生、發展關系密切，給予糖尿病患者口服乳酸桿菌4周后，發現患者胰島素敏感性較治療前明顯改善[21]。推測MED能在一定程度上提高大鼠腸道Muribaculaceae和乳酸桿菌屬豐度，改善糖尿病治療效果。

2.5.3 PLS-DA

由圖7-a基于物種豐度的PLS-DA得出，MED2更顯著區別于其他MED處理組，且區別于STZ組，說明MED中劑量對糖尿病大鼠腸道菌群在物種豐度方面產生特定影響；由圖7-b可知，MED2組在功能豐度方面區別于對照組，說明MED2大鼠腸道菌群的功能不同于普通大鼠腸道菌群的功能；結合MED2組后期降血糖效果優于其他MED劑量組，可以推測MED中劑量對使糖尿病大鼠的腸道菌群產生了較為積極的影響，這些影響可能更有利于糖尿病大鼠血糖的降低。

a-基于物種豐度的PLA-DA;b-基于功能豐度的PLS-DA

2.6 血液有機酸

各處理組血液中丙酸、丁酸、正戊酸、異戊酸、新戊酸含量見圖8，各有計算含量均無顯著差異(P<0.05)，甲酸、乙酸、酒石酸未檢出。關于丙酸，STZ組、MED1組、MED2組的濃度相較于CK組均有升高趨勢，MED3 組未檢測出丙酸含量，MED2組相較于STZ組有下降趨勢，說明糖尿病可導致血液中丙酸含量的上升，而中劑量MED對此有緩解趨勢。丁酸僅在STZ組和MED2組中檢測出，其余組未檢出，說明糖尿病可引起丁酸含量的升高，而MED可緩解此趨勢。相較于CK組，STZ 組異戊酸濃度均有降低趨勢，相較于STZ組，MED組異戊酸均有升高趨勢，說明糖尿病可降低異戊酸含量而MED具有改善作用。各處理組正戊酸的變化趨勢和異戊酸相似，MED可阻止糖尿病引起的正戊酸變化。新戊酸僅在STZ組、MED1組和MED2組中檢測出含有新戊酸，且MED2組新戊酸濃度增高趨勢明顯，其余組未檢出。糖尿病具有改變大鼠血液中的有機酸如丙酸、丁酸、異戊酸和正戊酸的趨勢，而MED可改善糖尿病大鼠血液中有機酸的變化。

圖8 各處理組血液中有機酸的含量

3 結論

本文研究發現，MED灌胃對糖尿病引起的多飲癥狀有一定的緩解作用，低劑量和高劑量MED在短時間內對血糖升高有緩解趨勢，但后期效果不明顯；MED中劑量后期降血糖趨勢較其他MED劑量組好。MED對于糖尿病引起的肝臟系數和腎臟系數增大有一定的緩解作用；尤其中劑量MED對于降低糖尿病導致的大鼠各器官臟器系數的增大有較好的改善趨勢，但是會引起脂類在心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟中的蓄積。

糖尿病對大鼠體內腸道菌群有一定影響，中高MED可改善糖尿病引起的腸道菌群物種數量的降低；MED可以有效改善糖尿病大鼠雙歧桿菌屬的相對豐度至正常水平，但僅MED中低劑量組在一定程度上改善糖尿病大鼠Muribaculaceae的相對豐度，并且中劑量對使糖尿病大鼠的腸道菌群產生了較為積極的影響。同時糖尿病會對大鼠血液的有機酸濃度產生影響，而MED可以一定程度上調節糖尿病大鼠血液中有機酸如丙酸、丁酸、異戊酸和正戊酸的含量。本文初步研究了MED對糖尿病大鼠多飲癥、空腹血糖、臟器系數、脂類分布、腸道菌群以及血液中有機酸的影響，為MED在Ⅱ型糖尿病方面的作用提供一定的理論依據。