一株源自長壽老人的嗜酸乳桿菌PBIL2-003的分離鑒定及特性與功能評價

張化朋，李鳳娟，張顏廷，劉虹，莊金麗，劉敬蘭，王靜

(山東鳳凰生物科技股份有限公司，山東 泰安，271000)

益生菌是指食用一定量后對機體健康有益的活的微生物，它們能夠通過自身的繁殖代謝、調節微生物群的結構、發揮益生作用[1]。研究證實，腸道菌群是維持機體消化、代謝、免疫等重要生命活動平衡的重要因素[2]。免疫是人體健康的基石，機體免疫功能失調可能會引起過敏、炎癥、腫瘤或易受到病原微生物感染等健康問題。研究顯示，腸道菌群通過腸相關淋巴組織影響免疫系統的發展和調節，腸相關淋巴組織是機體抵御病原體、病毒和其他有害微生物的一道重要防線[3]。研究結果顯示，益生菌可通過增強腸道黏膜屏障功能，提高機體抗氧化功能并降低炎癥水平，調控免疫細胞活性和增強細胞吞噬功能等多種方式調節機體免疫功能，促進機體健康[4]。乳酸桿菌、雙歧桿菌等通過發酵腸道中不易消化的成分產生短鏈脂肪酸等有益代謝產物，降低腸道pH值，促進黏膜細胞的生長、降低炎癥、提高腸道的穩定性[5-6]。乳酸菌菌種資源豐富，廣泛存在于動植物、空氣、土壤等環境中，其中在動物體內和傳統發酵食品中尤為豐富。長壽人群作為一個特殊群體，研究顯示，其腸道菌群豐度及結構存在顯著差異，腸道菌群豐度增加，具有更高的多樣性，其中一些潛在的有益菌的豐度仍隨著年齡而富集[7-9]。本研究擬從長壽老人糞便中分離篩選益生菌菌株，并對其進行系統的理化特性、抗逆性及安全性分析，以及小鼠體內免疫功能和調節腸道菌群的評價，以期開發新的益生菌菌種資源，為功能性益生菌菌株的產業化研究及應用提供性能優良、安全的菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF級昆明小鼠(18±2)g(合格證：NO.370726200100423072)，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司；MRS固體培養基、EMB瓊脂(伊紅美藍瓊脂)、BEA瓊脂(疊氮鈉-結晶紫-七葉苷瓊脂)、BBL瓊脂、LBS瓊脂、TSC瓊脂(胰胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸瓊脂)培養基、脫纖維綿羊血，青島海博生物技術有限公司；濃鹽酸、異丙醇、2-巰基乙醇，均為試劑純，濟南天泰化工有限公司；NaCl、K2HPO4、氫氧化鈉、碳酸鈉、谷氨酰胺、乳酸鋰、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸鹽，均為試劑純，天津凱通試劑公司；豬膽鹽、胃蛋白酶、胰酶、RPM1640細胞培養液、小牛血清、刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)、噻唑藍[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]、Hank’s液、青霉素、鏈霉素、藥敏片，北京索萊寶試劑公司；YAC-1細胞，深圳市豪地華拓生物科技有限公司；乙基苯基聚乙二醇(NONIDET P40，NP40)，上海躍騰生物技術有限公司；環磷酰胺，山西普德制藥有限公司；印度墨汁，上海華藍化學科技有限公司。

1.2 儀器與設備

F50酶標儀，Infinite公司；CX21FS1電子生物顯微鏡，Olympus公司；ML204電子分析天平，Mettler Toledo公司；DHP-9162型電熱恒溫培養箱、BPN-50CH二氧化碳培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；CL5高速離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；THZ-C型恒溫振蕩器，蘇州培英實驗室設備有限公司；BCD-256 WDGH型冰箱，青島海爾股份有限公司；SJ-CJ-2D超凈工作臺，蘇潔凈化設備有限公司；BHC-1300-A2生物安全柜，蘇州通潔凈化科技有限公司；LDZX-75KBS高壓滅菌鍋，山東新華醫療器械公司；PHS-3C酸度計，上海雷磁科學儀器公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分離與鑒定

采集一位山東煙臺市百歲健康老人的新鮮糞便，用無菌取樣瓶封好后置入冰盒內，無菌條件下取糞便中部1 g樣品至100 mL帶玻璃珠的滅菌生理鹽水中，180 r/min搖勻30 min后，移液管吸取1～2 mL搖勻的混懸液于滅菌MRS液體培養基中，37 ℃厭氧富集培養24 h后，用無菌接種針蘸取培養液在含3%(質量分數)CaCO3的MRS固體培養基劃線，37 ℃厭氧恒溫靜置培養48 h后，挑取培養基上具有明顯透明圈的單菌落，接種到MRS斜面上培養24 h后進行革蘭氏染色、鏡檢。純化菌株送檢中科院微生物研究所進行菌株生理生化特性、16S rDNA基因序列、pheS基因序列等綜合分析鑒定。

1.3.2 抗逆性與安全性分析

耐酸耐膽鹽評價：將分離篩選獲得的菌株活化后，接種于滅菌的液體MRS培養基中培養20 h，按4%轉接量分別接種于pH 2.0和含0.3%(質量分數)膽鹽的滅菌MRS液體培養基中，37 ℃培養，分別于0、1、2 h取菌懸液，進行平板菌落計數，計算菌株耐酸耐膽鹽能力[10]。

人工胃液配制及菌株耐受性檢測：準確量取20 mL的1 mol/L鹽酸加蒸餾水調節pH值為2.5，加入胃蛋白酶(1 g/100mL)，充分溶解后，用孔徑為0.22 μm濾膜過濾除菌即可。菌液按2%(體積分數)接種于模擬胃液中，在37 ℃條件下培養0.5、1、2 h，取樣進行平板菌落計數，以0 h活菌數為對照，計算存活率[11]。

人工腸液配制及菌株耐受性檢測：參照關小鶯等[11]方法改進。取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至6.8，另取胰酶10 g，加水適量溶解，將兩液混合后加水稀釋至1 000 mL。菌液按2%(體積分數)接種于模擬腸液中，在37 ℃條件下培養2、4、6、8 h，取樣進行平板菌落計數，以0 h活菌數為對照，計算存活率。

藥敏試驗：將純化的菌體劃線取單菌落，懸于3 mL生理鹽水中，并調整菌體濁度為0.5麥氏單位。用棉簽均勻涂布MRS培養基表面，用滅菌鑷子取不同藥敏紙片貼于培養基表面，培養18～24 h后取出，通過測量抑菌圈直徑，確定菌株對不同抗生素的敏感程度[12]。

1.3.3 體內功能評價

體內功能評價實驗方法參考保健食品檢驗與評價技術規范(衛法監發[2003]42號)。

1.3.3.1 動物分組及飼養

實驗動物采用SPF級雄性昆明小鼠，體重(20±2) g，每組40只，預飼7 d后，進行灌胃給藥處理；實驗分組：設空白對照組、模型組、陽性對照組(某品牌增強免疫力保健食品，主要活性成分為1.1 g/100g總皂苷、0.3 g/100g粗多糖)和3個菌粉組，具體給藥劑量見表1，連續給藥30 d?？瞻讓φ战M除外，在第20天連續2 d小鼠腹腔注射免疫抑制劑環磷酰胺(40 mg/kg)進行免疫抑制造模處理，連續灌胃30 d后，進行實驗處理及指標檢測[13-14]。

表1 動物實驗分組及處理方式

1.3.3.2 免疫器官指數測定

末次給藥結束后，禁食不禁水12 h，稱量小鼠體重，采用斷頸處死小鼠后，解剖取小鼠脾臟和胸腺，去除粘連組織，濾紙吸干后稱重，免疫臟器指數計算如質量公式(1)所示：

(1)

1.3.3.3 ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化實驗

小鼠實驗期滿，無菌取出脾臟，置于盛有Hank′s液的平皿中，用鑷子輕輕將脾磨碎，經200目不銹鋼網篩過濾，1 000 r/min離心5 min，用Hank′s液清洗兩次，棄清液，收集細胞重懸于完全培養液中，用臺盼藍染色后計數活細胞數，保證活細胞比例≥95%，調整脾細胞濃度為3×106個/mL備用。

脾細胞增殖試驗：將脾細胞懸液分兩孔加入至24孔培養板中1 mL/孔，取一孔加75 μL 7.5 μg/mL的ConA液，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中連續培養68 h，每孔吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清RPMI1640培養液及50 μL濃度為 5 mg/mL 的MTT液，繼續培養4 h，加入1 mL酸性異丙醇，吹打均勻至完全溶解紫色結晶后分裝至96孔板，然后用酶標儀在570 nm處測定光密度值(OD)，添加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細胞的增殖能力。

1.3.3.4 小鼠血清凝血素的測定

小鼠血清凝血素的測定采用血凝法，取脫纖維綿羊血，用生理鹽水洗滌離心(1 000 r/min，5 min)3次，將壓積脫纖維綿羊血細胞用生理鹽水配成2%(體積分數)的細胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2 mL進行免疫，5 d后，摘除眼球取血，37℃水浴30 min使血清析出，離心(3000 r/min，10 min)收集血清。

取微量血凝板，每孔加100 μL血清，用生理鹽水倍比稀釋血清，再加入100 μL 0.5%(體積分數)SRBC懸液，混勻，加蓋后于37 ℃培養箱孵育1 h，觀察血球凝集程度。血清凝集程度按照5級(0～4級)記錄，按照公式(2)計算抗體積數:

抗體水平=(S1+2S2+3S3……nSn)

(2)

式中:1，2，3……n代表倍比稀釋的指數，S代表凝集程度的級別。

1.3.3.5 小鼠碳廓清實驗

末次給藥結束后，禁食不禁水12 h，稱量小鼠體重，從小鼠尾靜脈注射印度墨汁(100 mL/kg，生理鹽水稀釋4倍)，注入墨汁2 min和10 min后，用毛細管從眼眥靜脈取血20 μL，立即吹打至2 mL 0.1%(質量分數)Na2CO3溶液中，用Na2CO3溶液作空白對照，測定600 nm處光密度值。同時處死小鼠，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干血污后精確稱重。按照公式(3)～公式(4)計算吞噬指數A:

(3)

(4)

式中：OD1為注射墨汁后2 min(t1)光密度值；OD2為注射墨汁后10 min(t2)光密度值。

1.3.3.6 自然殺傷細胞(natural killer cell，NK細胞)活性測定

實驗前24 h將靶細胞進行傳代培養，用Hank′s液清洗3次，用RPMI1640培養液調整細胞濃度為4×105個/mL。

效應細胞制備：無菌取出脾臟，置于盛有Hank′s液的平皿中，通過磨碎處理，制備單細胞懸液，過濾后用Hank′s液離心(1 000 r/min，10 min)處理清洗2次，加入滅菌水裂解紅細胞，再加入Hank′s液進行離心處理，用1 mL含10%小牛血清的RPMI1640培養液重懸，用1%(體積分數)冰醋酸稀釋后計數，保證活細胞比例≥95%，調整脾細胞濃度為2×107個/mL。

NK細胞活性測定，取靶細胞和效應細胞各100 μL，加入到U型96孔培養板中，作為反應孔，自然釋放孔依次加100 μL靶細胞和培養液，最大釋放孔依次加100 μL靶細胞和1%(體積分數)NP40，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養4 h，離心(1 500 r/min，5 min)處理，每孔吸取100 μL加入到平底96孔培養板中，加入100 μL乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)基質液，室溫反應5 min，后加入30 μL 1 mol/L的鹽酸溶液，用酶標儀在490 nm處測定光密度值(OD)。按照公式(5)計算NK細胞活性：

(5)

1.3.3.7 腸道菌群測定

實驗動物剖殺后，無菌條件下取盲腸糞便，精確稱取1 g置于100 mL生理鹽水中，37 ℃恒溫搖床振蕩，采用平板計數法進行梯度稀釋，選擇合適梯度接種于不同細菌的選擇培養基：EMB瓊脂、BEA瓊脂、BBL瓊脂、LBS瓊脂、TSC瓊脂培養基，培養后以菌落形態、革蘭氏染色鏡檢、生化反應等鑒定計數菌落，分別計算出每克濕便中腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌和產氣莢膜梭菌的活菌數。

1.4 數據處理

采用SPSS Statistics 20軟件對數據進行統計分析。試驗數據均以平均值±標準誤差表示，檢驗方法采用t檢驗，P<0.05為具有統計學意義，即差異顯著，P<0.01為極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 分離與鑒定結果

通過鑒定分析，分離出的菌株屬于乳桿菌科中的乳桿菌屬，革蘭氏陽性桿菌，末端呈圓形，兼性厭氧菌，在pH 4.5～9.5生長，最適pH 6.5左右，接觸酶和氧化酶陰性，γ溶血。菌體呈長桿狀或者呈對狀，兩端鈍圓，不產生芽孢(圖1)；在MRS瓊脂培養基中呈乳白色、半透明狀圓形小菌落、邊緣不規則。

圖1 菌株的顯微鏡檢圖(×4 000)

菌體API 50CH系統鑒定如表2所示，該菌種屬于同型發酵乳酸菌，能夠發酵果糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖。通過菌株細胞形態、生理生化特性、16S rDNA基因序列、pheS基因序列等綜合分析，該菌株鑒定結果為嗜酸乳桿菌，命名為嗜酸乳桿菌PBIL2-003(LactobacillusacidophilusPBIL2-003)(簡稱L2-003)。

表2 菌株L2-003 API 50CH系統鑒定結果

2.2 抗逆性與安全性

菌株L2-003耐酸耐膽鹽結果顯示：在pH 2.0條件下，2 h內存活率>20%；在0.3%膽鹽濃度下，2 h內存活率>20%，具有較好的耐酸耐膽鹽能力(表3)。

表3 菌株L2-003在pH 2.0及0.3%膽鹽的MRS液體培養基中存活率

菌株L2-003在人工胃液中存活率見表4，菌株L2-003在人工胃液中0.5、1、2 h時的存活率分別為61.18%、54.25%、50.24%，存活率較高，具有較好的耐人工胃液能力，與菌株L2-003具有較好的耐酸特性結果相符。

表4 菌株L2-003耐受人工胃液存活率

如表5所示,菌株L2-003具有較好的耐酸和耐膽鹽特性，能夠有效通過胃液和膽鹽，并可在人工腸液環境中較好的存活并增殖。

表5 菌株耐受人工腸液存活率

對益生菌菌株的耐藥性進行檢測與分析，對于益生菌制品的安全性十分必要。菌株篩選過程中，應選擇對常用抗菌藥物敏感的菌株，以減少耐藥性傳遞的安全隱患。選用常見的30種抗生素進行耐藥性測定，參考美國臨床實驗室標準委員會的藥敏試驗標準進行分析，結果見表6，菌株L2-003僅對復方新諾明和阿米卡星有抗性，對慶大霉素中度敏感，對其余27種抗生素均敏感，說明菌株L2-003對抗生素耐藥譜較窄，具有較高的安全性。

表6 菌株L2-003對抗生素的敏感實驗結果

2.3 動物體內功能評價結果

2.3.1 小鼠免疫指標檢測

實驗過程中監控實驗小鼠的生長情況及狀態，結果顯示,實驗期中各實驗組小鼠生長狀況較好，體征及狀態無不良變化，未出現明顯疾病及死亡情況，表明菌株L2-003對實驗小鼠無明顯毒性作用。

小鼠免疫檢測結果見表7，造模處理后，模型組的脾臟指數和胸腺指數顯著降低(P<0.01)，說明使用環磷酰胺進行免疫抑制造模成功。與模型組相比，陽性組、中劑量和高劑量菌株L2-003給藥組，小鼠的脾臟指數和胸腺指數顯著高于模型組。付彥君等[15]研究報道乳酸菌可通過促進小鼠胸腺和脾臟等免疫器官的發育，提高機體免疫功能。本研究結果顯示，陽性對照組與中高劑量L2-003組可通過促進小鼠免疫器官的發育，改善免疫抑制劑造模后小鼠的免疫功能；ConA誘導脾淋巴細胞增殖檢測結果顯示，空白對照組與模型組相比，光密度差值具有顯著性差異(P<0.01)，說明免疫抑制劑環磷酰胺顯著降低了小鼠脾淋巴細胞的增殖能力；陽性組、中劑量和高劑量L2-003菌株組光密度差值顯著高于模型組(P<0.05)，高劑量組淋巴細胞增殖能力接近陽性對照組，說明一定劑量L2-003菌株可顯著促進小鼠脾淋巴細胞增殖；空白對照組與模型組相比，抗體積數具有顯著性差異(P<0.05)，說明免疫抑制劑顯著降低了小鼠的抗體分泌能力；中劑量和高劑量L2-003菌株組抗體水平顯著高于模型組，說明一定劑量L2-003菌株可以有效促進小鼠血清凝血素的分泌，增強小鼠機體體液免疫能力。

表7 不同處理小鼠脾臟和胸腺臟器指數、淋巴細胞增殖活性、血清凝血素、碳廓清指數、NK細胞活性檢測結果

小鼠碳廓清實驗是通過小鼠尾靜脈注射墨汁，在不同時間測定小鼠的血液光密度值，在一定范圍內，體內碳顆粒被清除速率與血碳濃度呈指數函數關系，計算吞噬指數表示小鼠碳廓清能力，來反映單核吞噬細胞對外來異物的吞噬功能，進一步體現機體的免疫能力[16]。小鼠碳廓清吞噬指數結果顯示，與模型組相比，空白對照組對墨汁吞噬能力具有顯著性差異(P<0.01)，說明免疫抑制劑顯著降低了小鼠吞噬細胞的吞噬能力；與模型組相比，L2-003低劑量和中劑量組吞噬指數增加，但沒有顯著性差異；與模型組相比，L2-003高劑量組顯著差異(P<0.05)，免疫抑制小鼠的細胞吞噬能力顯著增強。

NK細胞由骨髓中的淋巴干細胞分化而來，可直接殺傷病毒感染細胞、腫瘤細胞和異體細胞。當細胞受到NK細胞殺傷后，活細胞胞漿內的LDH可以透過細胞膜，釋放到胞外，進一步反應生成紫紅色化合物，可在酶標儀490 nm比色測定，計算獲得NK細胞活性，獲得機體非特異性免疫水平。小鼠NK細胞活性檢測結果顯示，與空白對照組相比，免疫抑制模型組小鼠NK細胞活性顯著降低；與模型組相比，陽性對照組、中劑量組小鼠NK細胞活性顯著提升(P<0.05)，高劑量組差異極顯著(P<0.01)。

2.3.2 小鼠腸道菌群檢測

小鼠盲腸內菌群計數檢測結果見表8，與空白對照組相比，通過免疫抑制劑處理，小鼠腸道乳酸桿菌數量極顯著降低(P<0.01)，雙歧桿菌數量顯著降低(P<0.05)，腸桿菌和腸球菌無顯著性變化，產氣莢膜梭菌顯著增高(P<0.05)，說明通過造模處理后，小鼠腸道菌群平衡被破壞；通過不同組給藥處理后，與模型組相比，陽性對照組和低劑量L2-003活菌處理組對小鼠腸道乳酸桿菌、腸桿菌、腸球菌無顯著影響。3個劑量L2-003活菌處理組雙歧桿菌數量顯著增加，中劑量組乳酸桿菌顯著增加，差異顯著(P<0.05)；高劑量組乳酸桿菌數量顯著增加，差異極顯著(P<0.01)；與模型組相比，低劑量組產氣莢膜梭菌、中高劑量組腸桿菌和產氣莢膜梭菌，顯著下降(P<0.05)。一定劑量的L2-003可通過促進有益菌、抑制有害菌增殖，起到調節和平衡腸道菌群的作用。

表8 小鼠腸道菌群測定結果 單位：lgCFU/g

綜上，嗜酸乳桿菌L2-003可有效改善免疫抑制小鼠腸道菌群，增強免疫器官指數及免疫細胞功能，促進免疫細胞增殖，提高免疫細胞活性，提高機體特異性免疫和非特異性免疫水平，在中高劑量體現出更高的免疫增強活性。說明菌株L2-003可順利通過胃腸消化道進入機體并發揮益生作用，與生理生化和耐受特性結果一致。

3 結論與討論

研究篩選食品可用益生菌菌株特性及其體內功能作用及其機理，對于菌株的產業化應用及進入體內后的安全性與功能性具有重要的意義。乳酸菌能否通過胃腸道低pH值、高膽鹽濃度的環境存活，并可通過胃腸道的消化液消化而在腸道內黏附定植，對于其在腸道內的功能發揮至關重要。乳酸桿菌具有良好的抗生素敏感性，對酸和膽鹽環境具有良好的耐受性，經口飼喂后無中毒情況發生，口服乳酸桿菌可以調節腸道菌群結構，表明供試菌株具有良好的安全性和益生特性，可作為生產用菌株應用[17-18]。本研究從健康長壽老人糞便中分離獲得一株嗜酸乳桿菌PBIL2-003(LactobacillusacidophilusPBIL2-003)。研究結果證實，該菌株具有較好的耐酸、耐膽鹽特性；藥敏試驗結果顯示，L2-003僅對復方新諾明和阿米卡星有抗性，對慶大霉素中度敏感，對其余27種抗生素均敏感，說明L2-003對抗生素耐藥譜較窄。以上結果顯示，L2-003具有較好的抗逆性及安全性，可順利通過胃腸道消化液并發揮益生作用，具有較好的應用價值。

腸道菌群是維持腸道系統功能的重要物質，腸黏膜表面形成的腸道黏膜屏障和免疫屏障是保障腸道菌群維持動態平衡的重要環節，免疫系統可以維持宿主與高度多樣性并不斷發展的菌群之間的共生關系，誘導對病原體的保護性應答。研究顯示，益生菌可以通過自身增殖過程，產生有益代謝產物，調節腸道菌群，促進機體免疫功能，研究發現乳酸桿菌可以通過促進小鼠脾淋巴細胞增殖，激活免疫細胞活性，提高機體免疫分子分泌等作用，提高機體免疫力[19-20]。本研究結果顯示，篩選出的嗜酸乳桿菌L2-003具有促進有益菌生長、抑制有害菌增殖的作用；體內免疫功能評價結果顯示，L2-003可促進脾淋巴細胞的增殖，提高機體細胞免疫應答能力，促進機體抗體產生；顯著增強巨噬細胞吞噬活性和NK細胞殺傷活性，廣泛參與機體特異性免疫和非特異性免疫反應，顯著提升免疫抑制造模小鼠的機體免疫力水平，具有較好的促進機體免疫功能。綜上所述，嗜酸乳桿菌L2-003具有良好的抗逆性與安全性，具有調節腸道菌群和免疫提升作用，可作為功能性益生菌菌株應用于健康產品開發中。

大量研究報道顯示，人體腸道菌群因遺傳、飲食結構、生活方式、地理環境、年齡、性別及不同的健康狀況等因素的差異，而具有顯著性差異。長壽人群腸道菌群具有高多樣性的典型特征；維持高多樣性且均衡的腸道菌群對于老齡化過程中的健康可能起積極作用；健康長壽老人作為功能性益生菌菌種資源的特殊來源，已引起廣泛關注[21]。作為一株具有良好產業應用價值的益生菌菌種資源，不僅需要其來源安全，同時還需要其具有良好的特性、安全性、功能性。尤其是作為可食用的益生菌菌株，其進入機體后與機體的腸道菌群以及代謝、免疫等重要的生理活動間的相互作用及影響，及其相互作用靶點和機理研究，均需要更深入的研究與探討，以便為行業提供性能優良、食用安全的本土菌種資源，并為其產業應用提供嚴謹充分的參考依據。