噬菌體防控沙門氏菌生物被膜的研究進展

李曉宇，遲新月，王林會，馬永生，魏炳棟，王麗麗，張慧君，孫曉雯，李仕彬，李紀彬，徐永平*

1(大連理工大學 生物工程學院，遼寧 大連，116024)2(大連賽姆生物工程技術有限公司，遼寧 大連，116620)3(大連海洋大學 食品科學與工程學院，遼寧 大連，116023)4(吉林省農業科學院 畜牧分院，吉林 公主嶺，136100)

沙門氏菌(Salmonellaspp.)屬于腸桿菌科、革蘭氏陰性兼性厭氧菌，血清型共有2 600多種，是全球范圍內導致食源性疾病的重要病原菌之一。沙門氏菌極易污染水源、動物性食品(如肉蛋奶等)、生鮮果蔬等，嚴重威脅公共健康和食品安全。可引起的食物中毒主要表現為傷寒、急性腸胃炎和敗血癥等，一旦進入血液，會導致系統性炎癥甚至死亡。在歐盟，沙門氏菌近年來一直是危害僅次于空腸彎曲桿菌的第二大常見人畜共患病致病菌[1]。在美國，沙門氏菌每年導致約135萬例疾病、26 500例住院治療和420例死亡[2]。我國在2020年共計爆發286起沙門氏菌食物中毒事件，造成3 446人次患病，占細菌性食物中毒的首位[3]。

食品受致病菌污染的途徑很多，其中交叉污染尤其是固體食品與食品加工接觸面之間的接觸污染是食品加工業中污染率最高的污染途徑。沙門氏菌可以黏附于不同的食品加工接觸面如不銹鋼、玻璃、鋁箔、聚乙烯和聚氟乙烯等，產生大量的多聚物基質包裹在自身菌體外，形成生物被膜(biofilm)保護細菌在惡劣條件下生存并轉移到新環境，加速細菌的交叉污染[4]。多種食品生產線的加工接觸面中已檢測到沙門氏菌生物被膜的存在，并引發多起食物中毒事件。與浮游菌相比，生物被膜能夠大大提高致病菌對各種化學殺菌劑和環境變化的耐受性，這使得即使在食品加工過程中經過嚴格的清洗消毒程序也難以有效將其去除，從而造成持續污染[5]。因此，控制食品中沙門氏菌的污染，特別是防止其形成生物被膜交叉污染食品，成為食品工業面臨的嚴峻挑戰。

食品工業中控制的傳統方法主要是熱殺菌(高壓蒸汽滅菌、微波加熱等)和化學消毒(二氧化氯、過氧乙酸、季銨鹽類等)[6-7]。然而熱殺菌會影響食品的感官和營養價值；化學消毒存在腐蝕食品加工設備、易使細菌產生耐藥性、消毒劑殘留等食品安全問題。因此，亟待開發針對食源性致病菌生物被膜控制和清除的新型策略。

噬菌體(bacteriophage)是細菌的天敵，與化學消毒劑相比，具有特異性強、自我增殖快、安全性高、研發時間短等突出優勢[8]。自2006年以來，已陸續有多款噬菌體產品作為食品生物防控劑獲得美國食品藥物管理局 (Food and Drug Administration，FDA)批準，用于控制禽類、肉制品和其他食品中的單增李斯特菌、沙門氏菌等食源性致病菌污染[9]。這些進展突出了噬菌體控制食源性致病菌的巨大潛力，并證明了噬菌體在保障食品安全方面的可行性。近年來，隨著對噬菌體研究的深入，研究人員發現噬菌體及其衍生物不僅可以有效抑制生物被膜的形成，而且可以破壞已形成的生物被膜。本文針對沙門氏菌生物被膜的危害，綜述了國內外應用噬菌體破解沙門氏菌生物被膜的研究進展，詳細地闡述了噬菌體的作用機制及應用現狀，并對其未來研究方向進行了展望。旨在為沙門氏菌生物被膜的有效控制提供新的思路，為噬菌體的進一步開發與應用奠定理論基礎。

1 沙門氏菌的生物被膜

1.1 沙門氏菌生物被膜主要結構成分

生物被膜中的細菌嵌入在自產的胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)基質中，使其免受紫外線輻射、高鹽度、高壓、極端溫度與pH、抗生素和營養不良等極端環境的侵害[10]。EPS的組成取決于物種和環境條件，通常由多糖、蛋白質及核酸等組成[11]。卷曲菌毛、纖維素和細胞表面蛋白BapA是沙門氏菌生物被膜的主要基質成分，并且對生物被膜的形成以及在各種生物和非生物表面存活至關重要[12-13]。

卷曲菌毛是淀粉樣纖維，與表面黏附、細胞聚集、環境持久性和生物被膜形成等有關，是沙門氏菌細胞外基質中主要蛋白質成分[12]。參與生物被膜形成的另一種蛋白質是Ⅰ型菌毛，是最常見的黏附細胞器，決定著生物被膜形成時最初的黏附，并且是重要的毒力因子[14]。除此之外，LATASA等[15]報道BapA是腸炎沙門氏菌形成生物被膜所需的一種細胞表面蛋白，bapA的缺失會導致生物被膜形成能力的喪失，而bapA的過度表達使生物被膜的形成增加。通過CsgD的作用，bapA的表達與卷曲和纖維素的表達相協調，卷曲菌毛的過度生產可以彌補bapA缺陷株的生物被膜形成障礙[15]。

纖維素是沙門氏菌EPS胞外多糖組分中的一種重要物質，負責黏性結構和細胞間遠程的相互作用。塑料上生物被膜的持久性也受纖維素的影響，當腸炎沙門氏菌菌落在沒有營養物質的塑料上培養數月時，野生株的存活率比纖維素和菌毛缺陷的突變體高[16]。有研究報告了鼠傷寒沙門氏菌在巨噬細胞內產生纖維素，并且阻止纖維素的合成會增加細菌毒性[17]。這現象表明，纖維素是減弱沙門氏菌毒力的決定性因素。

除上述的基質成分外，胞外DNA(eDNA)也在生物被膜的形成中起關鍵作用，包括為固著細胞提供營養與能量促進生物被膜形成、促進細胞水平基因轉移(horizontal gene transfer，HGT)和為生物被膜結構提供穩定性[18]，WANG等[19]首次發現沙門氏菌生物被膜中存在eDNA，這導致沙門氏菌在聚苯乙烯和玻璃上生物被膜的形成較少，但對預先建立在聚苯乙烯和玻璃表面上的生物被膜結構沒有顯著影響。

1.2 細菌生物被膜的生命周期

細菌生物被膜的發育是一個復雜的、動態并且循環的過程，主要包括3個階段：附著/黏附、成熟和分散(圖1)[20-21]。附著可以進一步分為初始可逆附著和不可逆附著兩個階段，在附著過程中，鞭毛和Ⅳ型菌毛發揮著重要的作用，并且細菌在不可逆附著階段可以承受更強的物理或化學剪切力。生物被膜的第一層形成后，隨著細菌的增殖以及對流體中其他細菌的大量招募，細菌分泌越來越多的EPS，生物被膜也由一層發展為多層的成熟生物被膜。生物被膜成熟后，由于缺乏營養和細菌間競爭激烈等原因，最終導致生物被膜中的一部分發生分散，浮游細菌的釋放促進了其他表面新生物被膜的產生[22]。生物被膜循環往復的生命周期是其難以根除的一大原因，且生物被膜在不同生長階段對抗菌劑的耐受程度也不同，成熟的生物被膜更難被清除，因此預防生物被膜的形成變得更為重要。

圖1 細菌生物被膜形成過程

2 噬菌體防控沙門氏菌生物被膜的研究現狀

2.1 噬菌體的生命周期

噬菌體是一種感染細菌的高特異性病毒，由蛋白質和核酸組成，其生命周期可分為兩大類(圖2)：裂解周期和溶原周期[23-24]。在裂解周期中，感染過程始于噬菌體尾部蛋白不可逆的附著在細菌細胞表面的受體上，一旦噬菌體DNA進入宿主細胞，就會合成特定的酶來驅動宿主細胞產生新的噬菌體顆粒和細胞裂解所需的蛋白質。最終發生細胞裂解、子代噬菌體釋放和鄰近易感細胞感染。當噬菌體進入細胞內并未發生裂解，而是作為前噬菌體持續存在于宿主細胞基因組中，此時噬菌體進入了溶原周期。但不同的環境信號會導致進入溶原周期的噬菌體回到裂解周期。

圖2 噬菌體的生命周期

2.2 噬菌體作用于生物被膜的機制

自然界中生物被膜普遍存在，基質中的細菌與噬菌體之間的相互作用頻繁進行，近十余年來相關研究論文的數量逐漸上升[25]。噬菌體與生物被膜內細菌的作用不同于抗生素與消毒劑，這種差異背后有多種機制[26]：(1)當裂解性噬菌體在入侵宿主細胞后，釋放子代噬菌體，導致該部位噬菌體數量增加，通過基質擴散并消滅產生EPS的細菌；(2)生物被膜內持久性細胞可以被噬菌體感染，這些噬菌體即使不復制，也可以留在細菌細胞內直到他們被重新激活，然后開始進入裂解周期，最終裂解宿主；(3)噬菌體產生的多糖解聚酶，可以特異性識別、結合和消化宿主細胞的EPS，破壞生物被膜結構促進噬菌體滲透到內層侵染細菌[27]。

目前已有研究團隊鑒定出160個解聚酶，并且發現絕大多數解聚酶編碼在噬菌體結構蛋白(尾部纖維、基板或頸部)的開放閱讀框中，或與之非常接近，因此被認為是結構蛋白[27]。根據解聚酶的作用機制可將其分為兩類：水解酶和裂解酶，這兩種酶都可使多糖分解為可溶性低聚糖，并破壞碳水化合物屏障[28]。噬菌體編碼的內溶素(endolysin)屬于解聚酶的一種，它在噬菌體復制后期以水解酶的方式切割肽聚糖導致細胞破裂并釋放子代噬菌體，可作為抗菌劑使用[29-30]。圖3是噬菌體T5內溶素作用于大腸桿菌細胞壁的過程，該過程涉及4種特異性蛋白質的協同作用：穿孔素(holin)形成內膜孔提供進入周質的通道；內溶素降解細胞壁的肽聚糖；兩個跨膜蛋白i-spanin和o-spanin協助噬菌體蛋白在周質中相互作用，在裂解的最后階段使內外膜融合[31]。目前，已有很多研究表明內溶素具有良好的抗菌和抗生物被膜活性[32]。

IM-內膜；OM-外膜；PG-肽聚糖層

2.3 噬菌體及內溶素防控沙門生物被膜的應用效果

已有的研究表明，單一噬菌體、混合噬菌體或噬菌體與其他防控措施聯合使用，均對沙門氏菌生物被膜有一定的消除或抑制生長效果(表1～表3)。總體來看，與清除生物被膜相比，噬菌體在抑制生物被膜的形成方面效果更佳。GONZLEZ等[33]研究表明，噬菌體在生物被膜內的擴散受膜內生物量、菌株對噬菌體的敏感性、噬菌體濃度、以及膜內噬菌體滅活酶的影響。除此之外，生物被膜的生長時間也會影響噬菌體的作用效果。VIDAKOVIC等[34]發現生長48 h的生物被膜可被噬菌體迅速清除，而生長超過60 h后，噬菌體僅在生物被膜邊緣侵染，難以擴散到生物被膜內部，這主要歸因于成熟生物被膜基質中卷曲菌毛的保護作用。

表1 利用單一噬菌體防控沙門氏菌生物被膜的效果

目前針對單一噬菌體應用中存在的宿主譜窄、細菌易產生抗性的局限性，采用噬菌體雞尾酒、噬菌體的內溶素以及聯合其他防控措施防控沙門氏菌生物被膜的相關研究發展迅速，作用效果詳見表2和表3。相較于噬菌體單獨應用，上述方法對生物被膜的清除率有明顯提升。例如YüKSEL等[35]將噬菌體P22與外膜通透劑EDTA和乳酸鏈球菌素(Nisin)進行組合，在噬菌體效價較低時也可清除90%以上的生物被膜。內溶素與微酸性次氯酸水的組合可去除鼠傷寒沙門氏菌生物被膜99%的活菌。需要指出的是，內溶素使用前需用氯仿預處理菌液，以促進內溶素到達細菌的肽聚糖層，然而氯仿并不適用于食品工業的應用。

表2 利用噬菌體混合液防控沙門氏菌生物被膜的效果

表3 噬菌體與其他防控措施聯用防控沙門氏菌生物被膜的效果

3 總結與展望

沙門氏菌在食品及其接觸表面形成的生物被膜污染對于食品工業構成極大威脅，然而使用傳統的化學消毒劑難以有效將其完全去除而且極有可能誘發新的食品安全問題。本文系統綜述了噬菌體和其編碼的裂解酶破解沙門氏菌生物被膜的獨特優勢和巨大潛力，這無疑為解決沙門氏菌生物被膜的控制和清除提供了新的見解與思路。目前相關的研究在國外已經較為火熱，而國內對于噬菌體防控沙門氏菌生物被膜的研究尚處于起步階段。需要指出的是，應用噬菌體防控生物被膜也有其限制性因素，如噬菌體裂解譜窄及細菌易產生抗性、生物被膜基質的阻礙、基質內細菌多樣性等。因此，本文基于噬菌體防控沙門氏菌生物被膜的研究現狀，對其未來研究方向進行以下幾點展望。

(1)拓寬噬菌體的宿主譜：噬菌體的高度專一性特點導致噬菌體的宿主譜窄，并且細菌容易對其產生抗性，這極大地限制了噬菌體的應用。目前常見策略是開發噬菌體“雞尾酒”來拓寬噬菌體的宿主譜，但如何優化噬菌體組合，降低噬菌體耐受的可能性和速度是研發的熱點和難點。此外，還可以通過改變噬菌體尾絲蛋白的結構構建工程化噬菌體，從而擴大噬菌體的宿主范圍。

(2)提高噬菌體制劑的穩定性：食品加工過程中的外界條件，如pH、溫度以及抑制性化合物等會對噬菌體控制和清除生物被膜的效果產生影響。因此，開發可耐受外界環境因素的噬菌體及其裂解酶，對其實際的產業化應用至關重要。

(3)噬菌體與其他控制策略聯合：生物被膜致密的EPS基質會阻礙噬菌體對細菌受體的識別，被認為是限制噬菌體擴散到生物被膜中的主要障礙之一。目前使用噬菌體聯合其他控制策略作用沙門氏菌生物被膜已初顯成效，這種聯合作用方式能相互取長補短，有望最大程度地提高噬菌體的作用效果，將是未來噬菌體清除生物被膜的重要研究方向之一。