妊娠期糖尿病孕婦腸道菌群的組成變化及臨床意義

李 華，曾智華，陳秋玲，彭冬梅，鄧燕霞

(長沙市婦幼保健院產科，湖南 長沙 410000)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是最常見的妊娠并發癥之一，與孕產婦和圍產期結局風險增加有關[1]。然而，目前尚無可用于GDM的有效預測系統，其發病機制尚未完全闡明。微生物被認為是宿主新陳代謝和健康的重要貢獻者之一，妊娠期間孕婦腸道微生物群發生顯著變化，可能導致妊娠期代謝功能發生障礙，比如GDM。最近研究報告了GDM患者和血糖正常孕婦腸道微生物群的差異[2]，尚無法判斷因果關系。根據2021年《糖尿病的分類和診斷》指南[3]，所有患者在診斷GDM后都應該接受教育性飲食干預，進行精準營養指導，但孕婦的遵守情況存在很大差異。因此，本研究的目的是評估GDM患者體內的腸道微生物群組成是否在妊娠中期至妊娠晚期發生了變化，對飲食建議依從性較高的患者與依從性較差的患者比較，是否呈現出不同的微生物模式。

1 資料與方法

1.1 一般資料

于2021年6月至12月從長沙市婦幼保健院連續招募了31名GDM患者作為研究對象。納入標準：孕24～28周、漢族、經75g口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test，OGTT)診斷的GDM。排除標準：雙胎妊娠，懷孕期間使用過益生元/益生菌、抗生素或任何藥物，懷孕前或懷孕期間的任何病理狀況(已知的糖尿病、高血壓、心血管疾病、肺部疾病、自身免疫病、肝臟或腎臟疾病、甲狀腺功能障礙、癌癥、其他疾病/病癥)，不遵守研究方案。所有研究對象都服用葉酸補充劑。每位研究對象都簽署了書面知情同意書。

所有GDM患者都按照指南常規接受營養咨詢和飲食指導(碳水化合物占總能量的45%，快速吸收的糖占<10%的總能量，蛋白質占總能量的18%～20%，脂肪占總能量的35%，每天至少攝入20～25g纖維，不飲酒)[4]。此外，建議每天進行30min的適度運動(即快走)。根據指南[3]，在存在高血糖的情況下，醫生會開具胰島素治療處方。

1.2 樣本采集、人體測量和飲食信息

在診斷GDM(入組時，孕24～28周)時及在研究結束時(孕38周)或分娩前(如果是早產)，從所有孕婦中收集問卷、人體測量值、空腹血液樣本和糞便樣本。研究人員通過建立微信群與患者保持持續聯系，定期到醫院產檢，以了解孕期進展。研究對象在入組時和研究結束時完成了3天的飲食記錄(2個工作日和1個休息日)。向所有研究對象提供有關如何使用常見家庭措施記錄食物和飲料消耗的詳細信息。

1.3 血樣分析

通過葡萄糖氧化酶法測量孕婦血清葡萄糖，采用高效液相色譜法測定糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)水平。通過脂肪酶/甘油激酶終點法測定甘油三酯，膽固醇過氧化物酶法測定膽固醇，直接免疫抑制法測定高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)-膽固醇。通過電化學發光法(羅氏公司)測定胰島素。使用特種蛋白分析儀(深圳普門)免疫比濁法測定血清C-反應蛋白(C-reactive protein，CRP)值。

1.4 糞便DNA提取

從收集的孕婦糞便中提取核酸。使用RNeasy Power Microbiome KIT(美國Qiagen公司)從樣品中提取總DNA。加入1μL RNase(美國Illumina公司)以消化DNA樣品中的RNA，在37℃下孵育1h。使用QUBIT dsDNA檢測試劑盒(美國Life Technologies公司)對DNA進行定量，并以5ng/μL進行標準化。

1.5 16S rRNA擴增子靶測序

使用從糞便樣本中直接提取的DNA，通過擴增16S rRNA基因的V3～V4區域來評估微生物群。使用Agencourt AMPure試劑盒(美國Beckman Coulter公司)清潔PCR擴增子，并使用Nextera XT Index Kit(美國Illumina公司)標記所得產物。在第二個純化步驟之后，使用QUBIT dsDNA檢測試劑盒(美國Life Technologies公司)對擴增子產物進行量化。隨后，匯集來自不同樣品的等量擴增子。使用具有V3化學成分的MiSeq Illumina儀器(美國Illumina公司)進行測序，并生成250bp的雙末端讀數。

1.6 生物信息學分析

雙端讀取首先使用FLASH軟件組裝，并使用QIIME 1.9.0軟件進行質量過濾。以97%的相似性挑選的操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)被稀釋到每個樣本的序列數量最少。通過QIIME獲得的OTU顯示達到的更高分類分辨率；當分類分配無法到達屬時，會顯示姓氏。

1.7 統計學方法

腸道微生物群α多樣性通過Chao1指數評估，估計不同菌群的數量，并通過R語言中使用Vegan package68的多樣性函數計算香農多樣性指數以評估菌群豐富度。非正態分布的計量資料表示為中位數(四分位數)。通過配對樣本t檢驗或Wilcoxon配對檢驗比較計量資料的組間差異。通過卡方檢驗比較分類變量之間的差異。Spearman非參數相關性分析用于分析微生物類群的相對豐度與飲食、代謝變量之間的關系。采用多元回歸分析評估微生物類群豐度與營養攝入量之間的關聯。以P<0.05為具有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象的一般資料

與入組時(孕24～28周)相比，研究結束時(孕38周)孕婦的體重、BMI、收縮壓、空腹胰島素、總膽固醇、CRP、甘油三酯均顯著增加(P<0.05)，見表1。

表1 入組時和研究結束時研究對象的一般資料Table 1 General characteristics of participants at the time of enrollment and at the end of the

2.2 遵守飲食建議情況

營養咨詢后，35.5%(11/31)的孕婦表示遵守給定的飲食建議。依從者和非依從者入組時的特征比較差異無統計學意義(P>0.05)；研究結束時，與非依從者相比，依從者的糖、飽和脂肪酸攝入量減少，纖維攝入量增加(P<0.05)。依從者的空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR、CRP水平的變化均顯著小于非依從者(P<0.05)，見表2。

表2 依從者與非依從者的特征變化Table 2 Characteristics changes of those with compliance and those without

2.3 入組時和研究結束時孕婦的微生物群組成變化

與孕婦入組時相比，研究結束時孕婦的微生物群α多樣性值存在顯著差異，表現在物種豐富度、菌種數量和香農指數顯著升高(t值分別為6.752、7.623、6.539，P<0.05)，見圖1A。在屬水平的箱線圖顯示，研究結束時Bacteroides、Collinsella和Rikenellaceae的豐度顯著降低，而Blautia、Butyricicoccus、Clostridium、Coprococcus、Dorea、Faecalibacterium、L-Ruminococcus和Lachnospiraceae顯著增加，見圖1B。

2.4 飲食依從性與微生物群變化

入組時和研究結束時的微生物群在依從者和非依從者中的變化相似，見圖1B。在妊娠進展期間，Blautia、Coprococcus、Dorea和Lachnospiraceae在兩組中顯著增加，而Rikenellaceae減少。在研究結束時檢測到了特定的微生物群變化：依從者中的Bacteroides豐度顯著減少，非依從者中Faecalibacterium和L-Ruminococcus豐度顯著更高，見圖1B。

2.5 微生物群與營養攝入及代謝的關聯

Spearman相關性和多元回歸分析結果顯示，Faecalibacterium與蛋白質攝入呈正相關(ρ=0.34，P<0.05)，與空腹血糖變化呈負相關(ρ=-0.56，P<0.05)。Rikenecellaceae與收縮壓呈負相關(ρ=-0.53，P<0.05)。Blautia與HbA1c變化、空腹胰島素變化和HOMA-IR變化呈負相關(ρ值分別為-0.53、-0.37、-0.37，P<0.05)。Butyricimonas、Collinsella與空腹胰島素變化(ρ值分別為0.43、0.47，P<0.05)和HOMA-IR變化(ρ值分別為0.50、0.46，P<0.05)呈正相關，見表3。

注：A.箱線圖描述GDM患者在入組時和研究結束時糞便微生物群的α多樣性。B.箱線圖顯示OTU在屬水平上的相對豐度，基于糞便樣本中Wilcoxon配對檢驗差異顯著(P<0.05)。

表3 研究結束時微生物群組成與飲食、代謝變量之間的關聯Table 3 Relationships between microbiome composition and dietary and metabolic variables at the end of the study

項目ρβ95%CIPHbA1c變化(%) Blautia-0.53-0.08-0.11～-0.040.001空腹胰島素變化(μIU/mL) Blautia-0.37-0.45-0.69～-0.180.001 Butyricimonas0.4336.3314.64～57.440.002 Collinsella0.478.705.97～11.32<0.001 Coprobacillus0.416.543.31～9.66<0.001HOMA-IR變化(mmol/L×μIU/mL) Blautia-0.37-0.12-0.18～-0.090.002 Butyricimonas0.5011.286.46～15.88<0.001 Collinsella0.462.411.79～2.96<0.001

3 討論

3.1 胰島素敏感與微生物群豐度的關系

妊娠晚期胰島素敏感性降低被認為有利于支持胎兒生長和增加營養吸收。臨床研究發現，HbA1c水平與微生物群豐度相關[5]。動物研究中，移植了肥胖和瘦人糞便的小鼠顯示出OTU豐度與空腹胰島素和HOMA-IR水平呈正相關[6]。已發現較高的Bacteroides豐度與血漿葡萄糖水平升高相關[7]。在本研究中，Bacteroides與空腹胰島素變化和HOMA-IR變化呈正相關，表明Bacteroides參與血糖的調節。

3.2 妊娠期飲食變化對微生物群組成的影響

本研究的大部分患者食用了低纖維和高脂肪的飲食，這是一種與GDM相關的不健康飲食模式。她們中的大多數(約2/3)在接受營養建議后并沒有明顯改變其飲食習慣，并且表現出比依從孕婦更差的代謝和炎癥模式。孕婦增加了糖的攝入量，可能與胰島素抵抗增加有關。本研究發現營養攝入與微生物豐度之間幾乎沒有關聯。關于妊娠期腸道微生物群組成和飲食攝入的研究結果尚有爭議。有研究發現，細菌群和膳食攝入量之間沒有關系[8]，也有研究認為膳食脂肪、維生素D與變形菌增加有關[9]。這些發現證實了二者關系的巨大異質性，并說明研究結果比較的困難，這可能是由于不同的飲食習慣、荷爾蒙變化導致的微生物群重塑以及由GDM引起的胰島素抵抗。飲食模式的短期變化已被證明可以快速調節微生物群的組成。盡管人類腸道微生物群需要更長時間和持續的修改來塑造，但飲食改變后會發生快速但短暫的變化[10]。在本研究中，雖然微生物群在依從者和非依從者中的變化相似，但依從者的空腹血糖、胰島素抵抗和CRP值波動更小。

3.3 微生物群對孕婦炎癥、血糖、血壓的影響

在正常懷孕期間，會出現低度炎癥，并且GDM是一種促炎狀態[11]。本研究觀察到妊娠晚期CRP值較高。促炎和抗炎細菌種類的不平衡會引發人類的低度炎癥和胰島素抵抗[11]。Faecalibacterium作為一種抗炎共生細菌，隨著妊娠的進展顯著增加[12]。本研究中，我們發現Faecalibacterium豐度與空腹血糖值之間存在很強的負相關，支持了炎癥與代謝異常之間的關聯。因此，在宏基因組分析中，Faecalibacterium對2型糖尿病的診斷具有高度鑒別力[13]。此外，在人類糞便微生物群研究中發現，產丁酸鹽的細菌與糖尿病呈負相關[14]。在本研究中，分析發現舒張壓與Rikenellaceae之間的負相關關系。Rikenellaceae是一種丁酸鹽生產者，Rikenellaceae對超重孕婦的血壓具有保護作用，其產生丁酸鹽的能力主要與維持正常血壓有關[15]。

本研究也發現Collinsella和胰島素/HOMA-IR值之間存在直接關聯，這與其他研究報道一致[16]，GDM患者乳酸的產生促使Collinsella豐度增加，Collinsella可以通過降低肝糖原生成和發揮促炎作用來影響新陳代謝。此外，我們觀察到Blautia與HbA1c、IR呈負相關。研究表明，Blautia與高血糖癥之間存在直接關聯[17]，其他研究也發現Blautia的豐度增加表明腸道炎癥及血壓值降低、1型糖尿病和肥胖癥的風險降低，存活率增加[18]。

綜上所述，GDM患者在妊娠期間檢測到具有更高α多樣性的微生物群組成的變化，以及代謝/炎癥模式與特定細菌豐度之間的關聯。這些結果可能有助于制訂調節腸道微生物群的策略。