菜心BrHsfA3 基因克隆及其對高溫脅迫的響應

龐強強 孫曉東 周曼 蔡興來 張文 王亞強

（1. 海南省農業科學院蔬菜研究所，海口 571100；2. 海南省蔬菜生物學重點實驗室，海口 571100；3. 海南省蔬菜學院士團隊創新中心，海口 571100）

菜心（Brassica campestrisL. ssp.chinensisvar.utilisTsen et Lee），又名菜薹，是十字花科蕓薹屬白菜亞種的變種［1］。作為我國華南地區的特產蔬菜之一，其品質柔嫩，營養豐富，深受消費者的喜愛。菜心生長周期短，復種指數高，可周年生產供應，在應對蔬菜生產淡季上具有重要作用。菜心喜溫但不耐高溫，生長溫度超過30℃就會產生菜薹纖細、產量降低和品質下降等問題［2-3］。因此，培育耐高溫菜心品種是解決上述問題的根本措施。

熱激轉錄因子（heat stress transcription factor,Hsf）是調節生物細胞內熱激反應的一類重要因子，在高溫脅迫下通過與熱激元件（Hse）結合而激活下游基因的轉錄表達［4］。Hsf基因普遍存在于各種植物中，目前已發現甜瓜有22 個［5］、毛竹有41 個［6］、南瓜有36 個［7］、芥菜有60 個［8］、菜豆有30 個［9］Hsf基因。依據Hsf結構的不同，可將其分為A、B和C 三類家族，不同家族又分為多個亞族［10］。首個Hsf基因是從酵母中克隆得到［11］，后來研究者從番茄中獲得了第一個植物的Hsf基因［12］。HsfA3是熱激轉錄因子A 類家族的成員，在正常條件下，HsfA3 屬于組成型表達，分布在細胞質中；當受到非生物脅迫時，為誘導型表達，且作用在細胞核中［13-14］。HsfA3基因能夠直接或間接調控植物的生長發育和逆境反應過程。唐銳敏等［15］研究發現，馬鈴薯StHsfA3在耐熱過程中起到正調控作用，可能協同StHsp26-CP和StHsp70來增強過表達轉基因株系的耐熱性。擬南芥高溫脅迫轉錄組的數據顯示，HsfA3是唯一在各種高溫脅迫條件下和各個高溫脅迫時期都有穩定表達的兩個熱激相關基因之一［16］，在擬南芥中過表達或異源過表達番茄的HsfA3都可提高其耐熱性［17-18］。除了調控植物高溫脅迫響應過程外，HsfA3還可參與植物的干旱［19］、低溫［20］、鹽［21］、氧化［22］等其他非生物脅迫應答。

近年來，本團隊針對菜心耐熱性開展了一系列研究工作［23-25］，建立了菜心高溫脅迫轉錄組數據庫，并從中獲得了1 個差異表達基因。在此基礎上，本研究采用全基因合成法（PCR-based accurate synthesis, PAS）克隆了該差異表達基因的序列，并對其蛋白理化性質、蛋白結構、系統進化等進行生物信息學分析，同時利用RT-qPCR 技術分析該基因在高溫脅迫下的表達模式，以期為菜心耐高溫機理研究和耐熱育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2021年12月-2022年3月在海南省農業科學院蔬菜研究所蔬菜生物學重點實驗室進行。供試材料為苗期高溫脅迫鑒定及田間自然高溫鑒定均表現為耐熱的自交系CX1-7 和熱敏的自交系CX7-3［23］。挑選飽滿、大小一致的菜心種子播種于營養缽中，待植株長至3-4 片真葉時進行間苗，每個營養缽中留一株幼苗，每個自交系種植60 株。采用常規栽培管理方式培養至抽薹開花時，移入25℃/18℃（晝/夜）、12 h/12 h（晝/夜）、光照80%、濕度70%的人工氣候箱中預培養3 d，之后將其中30 株移入另一人工氣候箱內進行高溫脅迫處理，處理溫度為37℃/27℃（晝/夜），除溫度環境外，其他環境條件均與預培養時保持一致。分別取高溫處理0 h（CK）和6 h（T6）的菜心根、葉、薹和花，用液氮冷凍后置于-80℃冰箱保存備用，試驗均設3 次重復。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取及cDNA 合成 參考Trizol 試劑說明書（北京全式金生物技術有限公司）分別提取菜心根、葉、薹和花的總RNA。利用cDNA 合成試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）去除基因組DNA 并反轉錄合成cDNA。

1.2.2 基因克隆及生物信息學分析 從菜心高溫脅迫轉錄組數據庫中獲取基因片段后委托武漢天一輝遠生物科技有限公司進行全基因合成，得到基因全長序列。采用ORF finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預測氨基酸序列。采用Expasy 服務器中的Protparam 工具（https://web.expasy.org/protparam/）和ProtScale 工具（https://web.expasy.org/ protscale/）預測蛋白的基本理化性質。采用NetPhos 在線網站（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）分析蛋白的磷酸化位點；采用SignalP-5.0 在線網站（https://services.healthtech.dtu. dk/service.php?SignalP-5.0）預測蛋白的信號肽。采用NCBI-CDS 在線網站（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析基因編碼蛋白質的結構域。使用Heatster 在線工具（https://applbio.biologie.uni-frankfurt.de/hsf/ heatster/hsf_visualization_tool.php）對保守結構域進行注釋。采用SOPMA 在線軟件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma. html）預測蛋白質的二級結構。采用Swiss-Model 在線網站（https://swissmodel.expasy.org/）預測蛋白質的三級結構。將克隆獲得的片段在NCBI 在線網站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）用Blastp 進行同源序列搜索，選取和下載同源性高、可靠性強的蛋白序列，采用MEGA6.0 軟件中的鄰接法（neighbor- joining method）構建系統進化樹，重復計算次數設為1 000。

1.2.3 基因表達特性分析 分別將獲得的菜心根、葉、薹、花的cDNA 稀釋至100 ng/μL 作為RT-qPCR模板。以BrActin基因為內參基因［25］，根據菜心BrHsfA3基因序列設計特異性引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列信息見表1。參考北京全式金生物技術有限公司的TransStart? TopGreen qPCR SuperMix 試劑盒說明書進行熒光定量分析，目的基因的表達量用2-△△Ct法來計算，每個基因的表達反應重復3 次。

表1 基因克隆和表達分析引物Table 1 Primers used for gene cloning and expression analysis

1.2.4 數據統計及分析 采用SPSS22.0 軟件對數據進行統計分析，單因素分析采用Duncan 法，采用Excel2007 進行作圖。

2 結果

2.1 菜心BrHsfA3基因克隆

根據前期轉錄組獲得的菜心c27244.graph_c0 基因片段，通過全基因合成方法，獲得了ORF 序列長度為906 bp 的基因片段，編碼301 個氨基酸，含起始密碼子ATG 和終止密碼子TAA（圖1）。在擬南芥基因組網站進行BLAST 比對，發現其與擬南芥中AtHsfA3基因最為相似，結合轉錄組注釋結果，將其命名為BrHsfA3。

圖1 BrHsfA3 的ORF 序列及氨基酸序列Fig. 1 ORF sequences and amino acid sequences of BrHsfA3

2.2 BrHsfA3蛋白理化性質分析

采用Proparam 在線網站分析了BrHsfA3基因編碼蛋白質的理化性質，該蛋白分子式為C1488H2307N415O475S16，原子總數為4 701，相對分子量為34.12 kD，理論等電點為5.00，脂肪系數為55.42，平均疏水性為-0.827，不穩定系數為56.06。ProtScale 分析結果表明，BrHsfA3 蛋白質存在明顯的疏水區和親水區，其中在第5 位最高，為1.989；第44 位最低，為-3.022；表明BrHsfA3 蛋白為親水性蛋白（圖2）。NetPhos 磷酸化修飾預測分析表明，BrHsfA3 蛋白存在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸3 個磷酸化位點（圖3），其中絲氨酸磷酸化位點21 個，蘇氨酸磷酸化位點20 個，酪氨酸磷酸化位點3 個。利用SignalP-5.0 預測BrHsfA3 信號肽發現，該蛋白無信號肽（圖4），為非分泌蛋白。

圖2 BrHsfA3 蛋白疏水性/親水性預測Fig. 2 Prediction of the hydrophobic/hydrophilic of BrHsfA3 protein

圖3 BrHsfA3 蛋白氨基酸翻譯后磷酸化修飾預測Fig. 3 Prediction of phosphorylation site after amino acid translation of BrHsfA3 protein

圖4 BrHsfA3 蛋白信號肽預測Fig. 4 Prediction of the signal peptide prediction of BrHsfA3 protein

2.3 BrHsfA3蛋白結構預測分析

采用NCBI-CDS 在線網站分析BrHsfA3基因編碼蛋白質的結構域發現，該蛋白有1 個特殊位點，屬于Hsf_DNA-bind 超級家族，具有1 個Hsf 保守結構域（圖5-A）。在靠近N 端第11-51 位含有氨基酸殘基形成的DNA 結合結構域（DBD），第69-137位氨基酸殘基形成的寡聚化結構域（OD），第146-156 位氨基酸殘基形成的核定位信號（NLS），C 端第271-277 位氨基酸殘基形成的轉錄激活結構域（AHA）（圖5-B）。對BrHsfA3 蛋白的二級結構分析發現，BrHsfA3 蛋白二級結構中含有豐富的α-螺旋和無規則卷曲，其中參與形成α-螺旋的氨基酸有138 個，占總氨基酸的45.85%；142 個氨基酸參與形成無規則卷曲，占總氨基酸的47.18%；參與形成延伸鏈的氨基酸有12 個，占總氨基酸的3.99%；9個氨基酸參與形成β-轉角，占總氨基酸的2.99%（圖6）。利用Swiss-Model 工具得到了BrHsfA3 蛋白的三級結構，與二級結構預測結果相符，含有大量α-螺旋和無規則卷曲（圖7）。

圖5 BrHsfA3 蛋白的保守結構域及功能結構域Fig. 5 Conservative domains and functional domain of BrHsfA3 protein

圖6 BrHsfA3 蛋白二級結構預測Fig. 6 Prediction of BrHsfA3 protein secondary structure

圖7 BrHsfA3 蛋白三級結構預測Fig. 7 Prediction of the three-dimensional structure of BrHsfA3 protein

2.4 BrHsfA3基因系統進化分析

Blastp 同源性檢索發現BrHsfA3 與22 種植物的HsfA3 蛋白相似性較高，這些植物為甘藍型油菜（Brassica napus, KAH0907994.1）、 蕪 菁（B. rapa，XP_009122679.1）、 花 椰 菜（B. oleraceavar.Oleracea, XP_013611350.1）、 蘿 卜（Raphanus sativus,XP_018445490.1）、琴葉鼠耳芥（Arabidopsis lyrata subsp.Lyrata, XP_002873110.1）、 擬 南 芥（A.thaliana, NP_001318473.1）、 薺 菜（Capsella rubella,XP_006287844.1）、 亞 麻 薺（Camelina sativa,XP_019089984.1）、 棉 花（Gossypium hirsutum, XP_016691460.2）、白櫟（Quercus lobata，XP_03092673 0.1）、三裂葉薯（Ipomoea triloba, XP_031131419.1）、木槿（Hibiscus syriacus，XP_039026314.1）、木薯（Manihot esculenta, XP_021619963.1）、花生（Arachis hypogaea, XP_025634986.1）、 蘋 果（Malus domestica,XP_017191546.1）、狹葉羽扇豆（Lupinus angustifolius, XP_019426589.1）、 梨（Pyrusx bretschneideri,XP_009365327.1）、 葡 萄（Vitis vinifera, RVW482 07.1）、煙草（Nicotiana attenuata, XP_019250820.1）、牽牛花（Ipomoea nil, XP_019179577.1）、豇豆（Vigna unguiculata, XP_027936489.1）、 胡 楊（Populus euphratica, XP_011016541.1）。系統進化分析結果（圖8）顯示，BrHsfA3和甘藍型油菜、蕪菁、花椰菜、蘿卜等十字花科作物處于同一分支，說明其親緣關系較近。此外，蘋果、梨、白櫟、葡萄等聚為一支，煙草、三裂葉薯和牽牛花聚為一支，棉花、木槿、木薯和胡楊聚為一支，花生、狹葉羽扇豆和豇豆聚為一支，亞麻薺、薺菜、擬南芥和琴葉鼠耳芥聚為一支，表明HsfA3基因具有較高的保守性，所構建的系統發育樹與其進化情況基本一致。

圖8 菜心與其他科屬植物HsfA3 氨基酸序列的分子系統進化樹系統樹Fig. 8 Phylogenetic tree of HsfA3 amino acid sequence from flowering Chinese cabbage and other plants

2.5 BrHsfA3基因在高溫脅迫下的表達模式分析

從菜心高溫脅迫轉錄組數據庫中提取了BrHsfA3基因在高溫脅迫前后的FPKM 值，由圖9 可知，在正常溫度條件下，BrHsfA3在熱敏和耐熱自交系葉片中的表達量基本一致，高溫處理6 h 時，BrHsfA3基因在耐熱自交系CX1-7 葉片中的FPKM 值較對照明顯增加，熱敏自交系CX7-3 葉片中無顯著變化。為進一步驗證轉錄組數據的正確性，采用RT-qPCR 技術分析了BrHsfA3基因在高溫脅迫下的表達特性（圖10）。在正常溫度條件下，BrHsfA3基因在菜心的根、葉、薹和花中均有表達，其中BrHsfA3基因在熱敏自交系CX7-3 的根中相對表達量最高，其次是薹、葉，花中的相對表達量最低；BrHsfA3基因在耐熱自交系CX1-7 的不同組織中的相對表達量由高到低依次為薹>葉>根>花。高溫處理后，BrHsfA3基因在熱敏自交系CX7-3 的根中表達量顯著上調，在葉、薹和花中的表達量無顯著差異；在耐熱自交系CX1-7 葉和花中的BrHsfA3基因表達量受高溫誘導顯著上調，根和薹中的表達量無顯著差異。單獨來看，BrHsfA3基因在熱敏自交系 CX7-3 和耐熱自交系CX1-7 高溫處理前后葉片中的RT-qPCR 結果與轉錄組中的表達情況類似，說明轉錄組數據是真實可靠的。

圖9 BrHsfA3 基因在高溫脅迫處理下的FPKM 值Fig. 9 FPKM value of BrHsfA3 gene under heat stress

圖10 BrHsfA3 基因在高溫脅迫前后不同組織的相對表達量Fig. 10 Relative expressions of BrHsfA3 gene in different tissues under heat stress

3 討論

菜心作為喜溫蔬菜，在生長的各個階段都容易遭受高溫傷害，嚴重影響其生長發育，是造成產量和品質下降的主要非生物脅迫之一［26］。因此，闡明菜心高溫脅迫響應機制，挖掘耐熱基因，對于加速菜心耐熱育種具有重要意義。越來越多的證據表明，熱激轉錄因子在植物生長和非生物脅迫防御過程中具有重要作用［27-29］。

為了研究菜心耐高溫脅迫的分子機制，本研究克隆得到了BrHsfA3基因。序列分析顯示，BrHsfA3基因的ORF 長度為906 bp，編碼301 個氨基酸。理化性質分析顯示，BrHsfA3 蛋白相對分子量為34.12 kD，理論等電點為5.00，具有明顯的疏水區和親水區，為無信號肽的親水性蛋白，存在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸3 個磷酸化位點。氨基酸序列分析表明，該蛋白序列具有典型的Hsf 家族保守結構域，在N端含有高度保守的DNA 結合結構域和寡聚化結構域，在氨基酸序列的中部含有核定位信號結構域，C 端含有轉錄激活結構域，缺少核輸出信號結構域（NES），這種類似結構在辣椒CaHsfA3 中也有發現［30］。Hsf 蛋白結構的不同決定了各族轉錄因子行使的功能存在差異，A 類Hsfs主要負責熱激基因的表達調控，B 類和C 類Hsfs 缺少AHA 基元不具備激活功能［31］，因此推測BrHsfA3也可能具有轉錄活性和激活功能，這需要在后續研究中予以重點關注。BrHsfA3 蛋白二級和三級結構預測顯示，無規則卷曲和α-螺旋占比較高，這與前人在馬鈴薯［15］上的研究結果一致。系統發育分析表明，BrHsfA3 氨基酸序列與甘藍型油菜的親緣關系最近，表明BrHsfA3可能與甘藍型油菜BnaHsfA3具有相似的功能和作用機制。

在正常生長環境中，Hsfs幾乎處于低活性或無活性狀態，但當遭受不利于生長發育的情況時，Hsfs活性被迅速激發，特異性識別并與熱激元件結合，從而激活體內的防御系統，以提高自身的抗性，減輕脅迫造成的傷害。由于每個植物熱激轉錄因子的種類和結構不同，因此在脅迫響應機制和生長發育調控中的功能具有多樣性［32-33］。HsfA3 是植物形成耐熱性的重要因子之一［13，34］。已有研究表明，HsfA3 位于信號傳遞鏈的末端，擬南芥AtHsfA3是Dreb2A和Dreb2C的下游基因，其表達受它們的直接調控，從而提高植株耐熱性［35］。為了預測BrHsfA3基因的生物功能，本研究結合菜心高溫脅迫轉錄組數據庫和RT-qPCR 技術，分析了BrHsfA3基因在高溫下的表達模式，結果顯示BrHsfA3基因的在菜心根、葉、薹和花中均有表達。在正常溫度條件下，熱敏自交系CX7-3 根中的表達量明顯高于葉、薹和花，耐熱自交系CX1-7 的薹和葉中表達量顯著高于根、花。多數研究證明，HsfA3基因的表達對番茄［18］、多年生黑麥草［36］和甘藍型油菜［37］的耐熱性起正向調控作用，本研究中高溫脅迫下耐熱自交系葉、花和熱敏自交系根中表達量均顯著上調也直接證明了這一觀點。另外，對比BrHsfA3在不同自交系間的表達量發現，除根中外，耐熱自交系CX1-7 的葉、薹和花中在高溫前后的表達量始終高于熱敏自交系CX7-3，這與茄子SmHsfA3基因在葉片中的研究結果類似［38］。根中表達量則在熱敏自交系中較高，推測產生的原因可能是由于Hsf基因介導的耐熱調控機制非常復雜，BrHsfA3基因在不同耐熱性植株的不同組織中對高溫脅迫響應機制存在差異，耐熱性的形成是由不同的Hsf基因共同作用的結果。

4 結論

本研究成功克隆得到菜心BrHsfA3基因，該基因ORF 全長為906 bp，編碼301 個氨基酸。該蛋白相對分子量為34.12 kD，理論等電點為5.00，為無信號肽的親水性蛋白，存在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸3 個磷酸化位點，具有1 個Hsf 保守結構域和典型的DBD、OD、NLS 和AHA 結構域，含有豐富的α-螺旋和無規則卷曲。BrHsfA3與甘藍型油菜BnaHsfA3同源性最高。BrHsfA3基因在菜心不同耐熱性植株及其不同組織中均有表達，在正常溫度條件下，不同組織中耐熱自交系CX1-7 的表達量由大到小依次為薹>葉>根>花，熱敏自交系CX7-3 的表達量由大到小依次為根>葉>薹>花。高溫脅迫處理后，耐熱自交系CX1-7 的葉、花中和熱敏自交系CX7-3 的根中表達量均顯著上調，其余組織中該基因的表達不受高溫影響。