菊芋WRKY 轉錄因子家族基因的鑒定及分析

趙孟良 郭怡婷 任延靖

（1. 青海大學農林科學院 青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室，西寧 810016；2. 青海大學三江源生態和高原農牧業國家重點實驗室，西寧 810016）

菊芋（Helianthus tuberosusL.）又名洋姜，鬼子姜，屬菊科向日葵屬多年生草本植物［1］，原產自北美，18 世紀末傳入我國，常規用于腌制咸菜，隨著其開發利用價值的發掘，菊芋已被廣泛應用于食品開發、藥用、工業、綠化觀賞等領域［2-7］。同時菊芋又具有較強的環境適應性，它可以在干旱地、沙荒地、鹽堿地等不同類型的土壤中種植，且能夠正常生長［8-10］，并產生相當可觀的生物量。由于菊芋對貧瘠土地較強的適應性，已被廣泛應用于生態治理等領域［11-13］。除此之外，菊芋還可用于菊粉的提取以及功能食品［14］、動物飼料［15］等的開發。

WRKY 轉錄因子作為植物中最常見的一類轉錄因子家族之一，具有高度的保守序列和特殊功能，能夠參與植物響應生物和非生物脅迫［16］。研究發現，OsWRKY67 參與調控水稻（Oryza sativaL.）響應多種非生物脅迫，通過ABA 信號通路介導負向調控水稻苗期耐旱性［17］，而過表達水稻OsWRKY6能提高水稻對病原物的抵抗性［18］。在牛耳草（Boea hygrometrica（Bunge）R. Br.）中，BhWRKY11 轉 錄因子可通過調控BhGolS1基因的表達，促進轉基因煙草對干旱脅迫的耐受性［19］；在小麥中TaWRKYK2可與STZ和下游的抗旱基因RD29B啟動子結合，對干旱脅迫有積極的調控作用。

截至目前，空心菜（Ipomoea aquatica）［20］、睡蓮（Nymphaea colorata）［21］等WRKY 轉錄因子已有相關研究，但未見到有關菊芋WRKY 轉錄因子家族的相關研究。

本研究以菊芋的葉片為材料，進行轉錄組學測序，通過分析轉錄組數據中的WRKY 轉錄因子家族，對其進行鑒定及表達分析，以期明晰與菊芋響應干旱脅迫密切相關的WRKY 基因，為今后菊芋WRKY基因的克隆及功能驗證奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選取前期進行轉錄組與代謝組測序的青芋2 號菊芋品種為研究材料，于2020年4月種植于青海大學農林科學院園藝研究所試驗基地，正常田間肥水管理，9月下旬于開花期進行取樣，選取盛花時期的7 個組織（包括根、塊莖、花莖、葉、花瓣、管狀花和幼嫩種子），液氮速凍后，置于-80℃貯藏備用，每個樣品選取3 個生物學重復。

同時，采用25% PEG-6000 模擬干旱脅迫，分別選取處理0、18、24 和36 h 的菊芋葉片與幼根，液氮速凍后，置于-80℃貯藏備用，每個樣品選取3個生物學重復。

1.2 方法

1.2.1 RNA 的提取及第一鏈cDNA 合成 采用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit 提取總RNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 純度及完整性，微量紫外分光光度計檢測RNA 濃度及質量，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 合成cDNA，將cDNA 溶液稀釋為100 ng/μL，-20℃保存備用。

1.2.2HtWRKY基因的篩選 根據干旱脅迫下菊芋葉片的轉錄組信息（SUB8106956）、轉錄組組裝結果以及轉錄組測序注釋文件，以WRKY 為關鍵詞，依次在NR、Swissprot、Tremble 和KEGG 注釋文件中進行搜索，根據搜索到的測序序列Cluster 編號查找序列信息，將查找到的Cluster 序列提交至NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），進行在線BLAST 分析，再將獲得的比對序列提交至在線工具ExPASy-ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/） 中分析其序列特征，采用MEME3.0 分析序列的motif結構域。

根據Cluster 電子序列及NCBI 的比對結果，采用DNAMAN 9.0 軟件進行序列相似度分析，選取重疊區域，利用Primer Premier 5.0 軟件設計實時熒光定量PCR 引物，并且通過奧科（楊凌）生物工程股份有限公司合成引物，引物序列見附表1。

1.2.3 進化樹分析 選取能夠比對到NCBI 中的74個菊芋的Cluster 片段，以及NCBI 中下載的30 個擬南芥、30 個向日葵、40 個萵苣的WRKY 基因，采用MEGA X 軟件的最大似然方法構建系統進化樹。

1.2.4 組織差異表達分析與干旱脅迫誘導表達分析 通過實時定量PCR（RT-qPCR）檢測基因的表達情況，以25sRNA和Clath-3為內參基因，RTqPCR 反應體系為2 × Unique AptamerTMqPCR SYBR Green Master Mix（No Rox）10 μL、上下游引物各0.8 μL、模板cDNA（200 ng/μL）1 μL 和雙蒸水7.4 μL。擴增程序為95℃ 15 min；95℃ 10 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s，40 個循環。熔解曲線：95℃ 15 s，60℃1 min，95℃ 1 min，30 個循環，降溫：40℃ 30 s。采用2-ΔΔCt方法計算相對表達量。

2 結果

2.1 HtWRKY基因家族成員的鑒定及蛋白結構分析

通過篩選轉錄組數據，共發現117 個WRKY 基因，與NCBI 中WRKY 基因比對，發現部分Cluster序列比對到同一個WRKY 基因，綜合整理后，共鑒定出74 個WRKY 基因（附表2）。Expasy 分析顯示，序列長度為510-2 040 bp，平均序列長度為1 105 bp，編碼氨基酸數量為169-679 個，平均367 個，其中，序列最短的氨基酸是HtWRKY75-3，序列最長的是HtWRKY2-3，分子量為18 882.98-74 247.19，平均為40 639.5，等電點為5.13-10.19，最低的是HtWRKY40-2，最高的是HtWRKY51-3，親水性分析顯示，HtWRKY65-3 具有較強的親水性，HtWRKY7-2 具有明顯的疏水性。

2.2 HtWRKY基因的保守基序分析

利用MEME 在線軟件對菊芋74 個WRKY 基因的保守序列進行分析，結果（圖1）顯示，HtWRKY基因含有保守的Motif 基序的長度為25-50 個堿基。

圖1 HtWRKY 基因的保守基序標識Fig. 1 Conversed motif logo of HtWRKY genes

2.3 HtWRKY基因系統進化樹分析

利用MEGA X 軟件的最大似然法構建74 個HtWRKY基因的系統進化樹（圖2），被分為四大類。

圖2 HtWRKY 基因的聚類分析圖及基序位置Fig. 2 Phylogenetic relationship and motif locations of HtWRKY genes

在這四大類中，第一類包含23 個基因，檢測到的保守Motif 數量為2-11 個不等，平均含有5.8個Motif，主要含有的保守基序為Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4、Motif 8 和Motif 9；第二類包含19個基因，檢測到的保守Motif 數量為2-9 個，平均含有6 個Motif，主要含有的保守基序為Motif 1、Motif 2、Motif 3 和Motif 6；第三類僅包含3 個基因，檢測到的保守Motif 數量分別是2、4 和6 個，平均含有4 個Motif；第四類包含29 個基因，檢測到的保守Motif 數量為2-11 個，平均含有7 個Motif，主要含有的保守基序為Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4、Motif 8、Motif 9、Motif 14 和Motif 15。

2.4 WRKY家族基因的進化分析

為了進一步分析轉錄因子HtWRKY 與其他物種WRKY 基因之間的親緣關系，選取與菊芋（Helianthus tuberosusL.）親緣關系較近的向日葵（Helianthus annuus）和萵苣（Lactuca sativa），以及模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）進行家族進化分析，利用MEGA X 軟件對74 個菊芋WRKY 家族基因、30個向日葵WRKY 家族基因、40 個萵苣WRKY 家族基因以及30 個擬南芥WRKY 家族基因進行系統進化分析。結果（圖3）顯示，這些WRKY 基因分為了六大類，第一類33 個基因，其中菊芋WRKY 占27 個，其他分別是4 個萵苣和2 個擬南芥WRKY 基因；第二類40 個基因，分別包括菊芋、向日葵、萵苣和擬南芥的WRKY 基因15、8、11 和6 個，大部分HtWRKY 與這3 個物種的WRKY 聚為一小類；第三類2 個基因，分別是萵苣WRKY51 和擬南芥WRKY22；第四類23 個基因，分別包括菊芋、向日葵、萵苣和擬南芥WRKY 基因8、8、5 和2 個；第五類10 個基因，包含2 個HtWRKY、3 個HaWRKY、1 個LsWRKY 和4 個AtWRKY；第 六 類65 個 基因， 包 含21 個HtWRKY、11 個HaWRKY、18 個LsWRKY 和15 個AtWRKY，大部分HtWRKY 與這3 個物種中的WRKY 聚為一小類。

圖3 4 個物種WRKY 轉錄因子的系統進化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of WRKY transcription factors in four species

2.5 HtWRKY家族基因的組織特異性表達分析

為進一步明晰HtWRKYs在不同組織的表達特性，選取菊芋的種子、根、莖、葉、花瓣及塊莖為材料，以花為參考，運用RT-qPCR 分析HtWRKY的表達特性，結果（圖4）顯示，種子中，HtWRKY6-1、HtWRKY7-4、HtWRKY65-5、HtWRKY33-1、HtWRKY6-6、HtWRKY40-4、HtWRKY17-3、HtWRKY13、HtWRKY9-1、HtWRKY22、HtWRKY33-2和HtWRKY44表達量較高；根中，HtWRKY33-1、HtWRKY32-2、HtWRKY51-4、HtWRKY40-4、HtWRKY21、HtWRKY13和HtWRKY33-2表 達 量 較高；莖中，HtWRKY6-6、HtWRKY24、HtWRKY17-3、HtWRKY13、HtWRKY22、HtWRKY33-2表達量較高；葉 片 中，HtWRKY32-2、HtWRKY51-4、HtWRKY6-6、HtWRKY21、HtWRKY22和HtWRKY33-2表達量較高；花 瓣 中，HtWRKY41、HtWRKY26-3、HtWRKY51-4、H t W R K Y 6-6、H t W R K Y 4 0-4、H t W R K Y 2 4、HtWRKY17-3、HtWRKY13、HtWRKY9-1、HtWRKY22和HtWRKY33-2表達量較高，且花瓣中的表達量普遍高于種子、根、葉片和莖中的表達量；塊莖中，HtWRKY51-4、HtWRKY17-3和HtWRKY13表達量較高，說明菊芋WRKY家族基因的表達具有明顯的組織特異性。

圖4 HtWRKY 基因在PEG-6000 模擬干旱脅迫下的組織特異性表達水平熱圖Fig. 4 Tissue-specificity expression heatmap of HtWRKY genes under PEG-6000 -simulated drought stresses

2.6 HtWRKY家族基因在干旱脅迫后的誘導表達

參考前期菊芋葉片在干旱脅迫后的轉錄組信息，分析所鑒定出的74 個WRKY 基因在干旱脅迫后的表達水平變化，結果（圖5）顯示，有11 個基因明顯受到干旱脅迫的誘導表達，在PEG-6000 模擬干旱脅迫18 h 時表達量呈現顯著上升的變化，分別為HtWRKY70、HtWRKY50、HtWRKY17-2、HtWRKY2-4、HtWRKY6-2、HtWRKY40-1、HtWRKY75-2、H t W R K Y 7-5、H t W R K Y 5 5、H t W R K Y 3 3-2和HtWRKY9-2；有7 個基因在PEG-6000 模擬干旱脅迫24 h 表達量呈現顯著上升變化的趨勢，分別 為HtWRKY51-1、HtWRKY6-1、HtWRKY27、HtWRKY26-1、HtWRKY40-2、HtWRKY51-3 和HtWRKY75-3；有2 個基因在PEG-6000 模擬干旱脅迫24-36 h 表達量呈現顯著上升變化的趨勢，分別為HtWRKY6-5和HtWRKY40-4。

圖5 74 個HtWRKY 基因在PEG-6000 模擬干旱脅迫下的菊芋葉片中的表達水平熱圖Fig. 5 Expression heatmap of 74 HtWRKY genes under PEG-6000-simulated drought stress in H. tuberosus leaves

在根中，對干旱脅迫條件下74 個菊芋WRKY基因的表達進行RT-qPCR 檢測，鑒定出19 個HtWRKY基因在PEG-6000 模擬干旱脅迫的菊芋根中有表達，結果（圖6）顯示，與CK 相比，除了HtWRKY55在3 個處理時間下的相對表達量呈現先升高之后逐漸降低的趨勢，其他18 個HtWRKYs均呈現“升高-降低-升高”的變化趨勢。其中，HtWRKY20-1、HtWRKY32-1和HtWRKY75-3在干旱脅迫18 h 的相對表達量較高；HtWRKY51-1、HtWRKY2-1、HtWRKY65-5、HtWRKY58-2和HtWRKY75-3在干旱脅迫36 h 的相對表達量較高。

圖6 19 個HtWRKY 基因在干旱脅迫下菊芋根中的表達情況Fig. 6 Expressions of 19 HtWRKY genes in the Jerusalem artichoke roots under drought stress H. tuberosus

總之，發現HtWRKY51-1和HtWRKY75-3在菊芋葉片和根中均呈現高表達特性。

3 討論

WRKY 轉錄因子家族在生物和非生物脅迫響應中起著重要作用［22］，這與高等植物的多種生物過程有關。WRKY 蛋白可以通過在其啟動子位點與W-box 特異性結合來誘導或抑制其下游基因的表達，并最終激活其應激反應［23］，據報道，多數WRKY基因在干旱脅迫下呈現上調表達的特性。Chu 等［24］研究發現，棉花GhWRKY41正向調控轉基因煙草的耐鹽脅迫和耐旱性。Chen 等［25］報道了擬南芥中WRKY46、WRKY54 和WRKY70 轉錄因子參與了干旱反應。Zhang 等［26］認為WRKYs 參與了地梢 瓜（Cynanchum thesioides（Freyn）K. Schum.）抵御干旱脅迫的反應。EI-Esawi 等［27］研究發現，過表達AtWRKY30 轉錄因子可以提高小麥（Triticum aestivumL.）的耐熱性和耐旱性。Ghodke 等［28］分析了不同洋蔥（Allium cepaL.）基因型對干旱脅迫的響應發現，在抗逆品種中WRKY 轉錄因子的表達表現出高度上調，然而，目前對菊芋中WRKY基因的分布和功能少見報道。

本研究通過對干旱脅迫下的菊芋葉片進行轉錄組測序分析，篩選出了響應干旱脅迫的117 個WRKY 基因，通過與NCBI 的比對分析，去除比對重復的序列后，共鑒定出74 個WRKY 基因，分析其保守序列，發現含有保守Motif 基序的長度為25-50 個堿基不等。利用MEGA X 軟件的最大似然方法構建74 個HtWRKY基因的系統進化樹，結果顯示，這些基因能夠被分為4 大類，第一類包含23 個基因，第二類包含19 個基因，第三類僅包含3 個基因，第四類包含29 個基因。進化分析結果顯示，這些WRKY 基因分為了六大類，第一類包含33 個基因，第二類包含40 個基因，第三類僅包含2 個基因，第四類包含23 個基因，第五類共包含10 個基因，第六類包含65 個基因。目前，關于HtWRKYs在干旱脅迫下不同組織中的表達模式尚未見報道，本研究通過PEG-6000 模擬干旱脅迫，對不同菊芋部位的相對表達量進行了RT-qPCR 測定，結果發現，HtWRKY75-3在干旱脅迫36 h 時的表達量最高，達到188.71，后續可對該基因進行克隆驗證等工作。

植物體內的轉錄因子家族基因在植物應對逆境脅迫中起著至關重要的作用，轉錄因子主要根據其保守的DBDs［29］的特征氨基酸序列被分為幾個家族組。其中，DREB/CBF、NAC、MYB、WRKY 和bZIP 家族是在干旱過程中起作用的主要轉錄因子。

WRKY 蛋白屬于鋅指轉錄因子中WRKY-GCM1的超大家族［30］，存在于大多數植物中，并有助于提高植物抵御生物和非生物脅迫的能力［31-32］。研究發現OsWRKY11參與植物的干旱和熱響應［33］。OsWRKY45被認為對ABA 有響應，并在氣孔關閉中發揮作用，以提高植物應對干旱脅迫的能力［34］。HvWRKY38在大麥抵御干旱和寒冷時發揮著積極作用［35］。TaWRKY44的擬南芥超表達株系對ABA、干旱和鹽等脅迫處理的敏感性高于野生型，這與本研究中克隆獲得的菊芋WRKY 基因的功能相同［36］。

本研究結果還表明，HtWRKY參與了抵御干旱脅迫的作用，并揭示了HtWRKY基因與其他作物中已鑒定的WRKYs 的系統發育關系。綜上所述，這些結果為今后深入了解菊芋WRKY 基因家族的進化，及其在非生物脅迫響應中的關鍵作用提供了依據，在后續研究中可以通過遺傳轉化、染色質免疫沉淀、酵母雙雜交和酵母單雜交等手段，進一步研究HtWRKYs基因的功能和機制。

4 結論

在轉錄組數據中鑒定出74 個WRKY 基因，其長度為510-2 040 bp，Motif 基序為25-50 個堿基，大部分HtWRKY基因與其他WRKY 基因聚合為一類。HtWRKY基因在花瓣和塊莖中相對表達量較高，分別有20 個和19 個HtWRKY基因在菊芋干旱誘導表達分析的葉片和根中呈現誘導后表達量上升的趨勢，HtWRKY參與了抵御干旱脅迫的過程。

文章所有附表數據請到本刊官網下載（http://biotech.aiijournal.com/CN/1002-5464/home.shtml）。