二斑葉螨抗性木薯木質(zhì)素合成途徑基因表達特性研究

姚曉文 梁曉 陳青 伍春玲 劉迎 劉小強稅軍 喬陽 毛奕茗 陳銀華 張銀東

（1. 海南大學熱帶作物學院，海口 571000；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室 海南省熱帶作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心，海口 571101；3. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院三亞研究院 海南省南繁生物安全與分子育種重點實驗室，三亞 572000）

木薯（Manihot esculentaCrantz）是世界三大薯類作物之一，在世界糧食安全、生物質(zhì)能源和食品加工等領(lǐng)域具有不可替代的地位和作用［1-3］，木薯作為重要的能源和工業(yè)原料在我國熱區(qū)廣泛種植。二斑葉螨是世界危險性害螨［4］，也是我國木薯產(chǎn)區(qū)的四大危險性有害生物之一, 嚴重制約了我國木薯產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［5］。目前對于二斑葉螨的防治主要依賴化學藥劑，但化學防治過程中因施藥技術(shù)落后和藥劑難以靶標，導致農(nóng)藥有效利用率不足、農(nóng)藥的使用頻率及使用劑量不斷加大，造成農(nóng)藥殘留（residue）、害蟲抗藥性（resistance）、害蟲再猖獗（resurgence）等問題日趨嚴重［6］。因此，尋求安全有效綠色防控二斑葉螨的策略與方法，成為目前木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展中亟待解決的重要課題。

培育和利用抗蟲品種是國內(nèi)外公認的防治二斑葉螨最經(jīng)濟、有效、簡便的帶有方向性的防治途徑。植物中具有抗蟲功能的次生代謝物質(zhì)的創(chuàng)新利用是培育抗蟲品種的有效途徑［7］。木質(zhì)素是最重要的次級代謝物質(zhì)之一，是細胞壁的主要成分。木質(zhì)素是含量僅次于纖維素的生物高聚物［8］，作為一種復雜的酚醛聚合物，不僅能起到增強細胞壁剛性的作用，還是二次增厚植物細胞壁的主要成分［9］，因此，木質(zhì)素是防止害蟲和病原體的重要屏障。考慮到酚類物質(zhì)在植物防御策略中的作用，木質(zhì)素及其合成的中間體還能對害蟲起到直接與間接作用，如阿魏酸在抗性棉花品種中含量更高，且對棉鈴蟲的生長與存活存在影響，使得幼蟲體重增長遲緩、死亡率增高［10］，木質(zhì)素合成的中間體在作物抗蟲中的重要作用，也在水稻對褐飛虱［11］、蓖麻對蓖麻夜蛾［12］、棉花對玉米螟蛉［13］的互作研究中有較多報道［14］。

木質(zhì)素的生物合成是由兩類基因參與調(diào)控的，一類是苯丙烷代謝途徑基因，包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、反式肉桂酸4-單加氧酶（C4H）、4-香豆酸輔酶A 連接酶（4CL）基因；另外一類是木質(zhì)素特異合成途徑調(diào)控基因，由若干個調(diào)控基因組成［15］。木質(zhì)素的生物合成是由木質(zhì)素合成途徑中的關(guān)鍵基因調(diào)控，研究表明，抑制4CL基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因楊樹中的木質(zhì)素含量下降［16］，在轉(zhuǎn)基因煙草中下調(diào)了CCR基因，木質(zhì)素含量同樣顯著下降［17］。

迄今為止，雖有研究表明木薯中的單木質(zhì)素和木脂素能夠?qū)Ψ凼鸬骄苁承Ч?8］，然而木質(zhì)素及其合成途徑基因在木薯抗螨性中的作用尚未見報道。鑒于此，本研究系統(tǒng)分析了二斑葉螨取食前后木質(zhì)素合成基因表達變化情況及其與木薯抗螨性的相關(guān)性，闡明木質(zhì)素及其合成途徑在木薯抗螨性中的作用，為抗螨木薯新種質(zhì)創(chuàng)制及鑒定評價提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試木薯 抗螨木薯品種C1115、緬甸（Myanmar）、SC9，感螨木薯品種SC205、面包（Bread）、BRA900［6］均由本單位木薯種質(zhì)資源圃提供。

1.1.2 供試二斑葉螨飼養(yǎng) 二斑葉螨為本實驗室以豇豆長期繼代，室內(nèi)飼養(yǎng)的試驗種群。飼養(yǎng)溫度27℃，相對濕度70%。

1.1.3 候選木質(zhì)素合成途徑基因 根據(jù)KEGG 網(wǎng)站（https://www.kegg.jp/kegg/）中已經(jīng)發(fā)布的木質(zhì)素合成通路，并結(jié)合前人的文獻報道，選取在植物木質(zhì)素合成調(diào)控研究中最為廣泛的10 個基因作為候選基因，用于木薯木質(zhì)素合成基因表達差異與木薯抗螨性的相關(guān)性分析，分別是PAL（苯丙氨酸解氨酶）、4CL（4-香豆酸輔酶A 連接酶）、C4H（反式肉桂酸4-單加氧酶）、HCT（莽草酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶）、CSE（咖啡酰莽草酸酯酶）、CCoAOMT（咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶）、COMT（咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶）、F5H（阿魏酸-5-羥基化酶）、CCR（肉桂酰輔酶A還原酶）和CAD（肉桂醇脫氫酶）。

1.2 方法

1.2.1 二斑葉螨接種與取樣 二斑葉螨接種和取樣參照實驗室前期建立的方法進行［19］，每片葉均接種二斑葉螨50 頭，并用羊毛脂均勻涂抹包裹住木薯葉柄基部防止二斑葉螨在葉片間遷移。分別于螨害后1 d、4 d 采集葉片用于RNA 提取及含量測定等實驗，同時以同一時間采集的未接螨的相同品種木薯葉片為對照，每個螨害時間點設3 個重復。

1.2.2 實時熒光定量PCR 分析 根據(jù)KEGG 中已經(jīng)發(fā)布的木薯木質(zhì)素合成途徑信息，并結(jié)合前人的文獻報道，設計木薯木質(zhì)素合成途徑候選基因引物（表1）。提取不同螨害時間葉片的RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計（Thermo）檢測RNA 的完整性和純度。取1.0 μg 經(jīng)gDNA Eraser（TOLOBIO 公司）去除gDNA 后的RNA 樣品用于cDNA 合成。以木薯Meactin為內(nèi)參基因，RT-qPCR反應體系的配制參照2×Q3 SYBR qPCR Master Mix試劑盒（TOLOBIO，中國）。PCR 反應條件為95℃預溫育1 min 后，以40 個循環(huán)完成如下程序：95℃變性 15 s，56℃退火30 s，72℃延伸20 s。以未經(jīng)二斑葉螨為害的木薯葉片樣品為對照，螨害后的木薯木質(zhì)素合成途徑基因表達量變化情況以為害前的相對倍數(shù)表示，根據(jù)Livak 等［20］的 2-ΔΔCt方法計算而得，每個處理均設置3 個重復。

表1 木薯木質(zhì)素合成途徑候選基因引物Table 1 Candidate gene primers in the synthesis pathways of cassava（Manihot esculenta Crantz）lignin

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 采用Gradphad Prism 9 進行數(shù)據(jù)匯總整理，使用統(tǒng)計學軟件DPS（V15.10）進行基因表達量差異分析，采用Duncan’s 新復極差法方法進行數(shù)據(jù)間的多重比較（顯著性水平均為α = 0.05）。

2 結(jié)果

2.1 二斑葉螨取食前后抗、感木薯品種葉組織中的PAL基因表達差異分析

二斑葉螨為害后，PAL基因在感螨木薯品種SC205、面包（Bread）和BRA900 中的表達量變化不顯著（BRA900 螨害4 d 除外）。而在抗螨木薯品種C1115、緬甸（Myanmar）、SC9 中的表達量均表現(xiàn)出隨為害時間延長而逐漸升高的趨勢，其中螨害4 d 后，PAL基因在C1115 中的表達量顯著上升了2.84倍，在緬甸中顯著上升了5.49 倍，在SC9 中顯著上升了4.94 倍（圖1-A）。相關(guān)性分析結(jié)果表明，木薯品種抗螨性與螨害后PAL基因表達量的升高呈正相關(guān)（R=0.662 4）。進一步比較相同螨害時間內(nèi)抗、感螨木薯品種PAL基因的表達量變化發(fā)現(xiàn)，抗螨木薯品種C1115 的表達量在相同螨害時間內(nèi)，均顯著高于其他木薯品種（圖1-B）。

圖1 螨害前后不同時間各品種PAL 基因表達量變化Fig. 1 Changes of PAL gene expressions in different varieties at different times before and after mite infestation

2.2 二斑葉螨取食前后抗、感木薯品種葉組織中的4CL基因表達差異分析

二斑葉螨為害后，4CL基因在感螨木薯品種SC205、面包中的表達量顯著上升，在BRA900 中顯著降低。而在抗螨木薯品種C1115、緬甸、SC9 中的表達量均表現(xiàn)出隨為害時間延長而逐漸升高的趨勢，其中螨害4 d 后，4CL基因在C1115 中的表達量顯著上升了7.65 倍，在緬甸中顯著上升了1.49 倍，在SC9 中顯著上升了0.79 倍（圖2-A）。相關(guān)性分析結(jié)果表明，木薯品種抗螨性與螨害后4CL基因表達量的升高呈正相關(guān)（R=0.705 6）。進一步比較相同螨害時間內(nèi)抗、感螨木薯品種4CL基因的表達量變化發(fā)現(xiàn)，抗螨木薯品種的表達量在螨害4 d 后顯著高于感螨木薯品種（圖2-B）。

圖2 螨害前后不同時間各品種4CL 基因表達量變化Fig. 2 Changes of 4 CL gene expressions in different varieties at different times before and after mite infestation

2.3 二斑葉螨取食前后抗、感木薯品種葉組織中的C4H基因表達差異分析

二斑葉螨為害后，不同感螨品種中C4H基因的表達量變化并無一致性（在SC205 中表達量提高，在面包中無顯著變化，在BRA900 中顯著減低）。而在3 個抗螨木薯品種中，C4H基因的表達量均隨螨害時間的延長逐漸提高，其中螨害4 d 后，表達量分別較螨害前顯著提高了1.96 倍（C1115）、3.75 倍（緬甸）和1.30 倍（SC9）（圖3-A）。相關(guān)性分析結(jié)果表明，木薯品種抗螨性與螨害后C4H基因表達量的升高呈正相關(guān)（R=0.745 4）。進一步比較相同螨害時間內(nèi)不同木薯品種C4H基因的表達量差異發(fā)現(xiàn)，抗螨木薯品種中C4H的表達量并不一定高于感螨木薯品種（圖3-B）。

圖3 螨害前后不同時間各品種C4H 基因表達量變化Fig. 3 Changes of C4H gene expressions in different varieties at different times before and after mite infestation

2.4 二斑葉螨取食前后抗、感木薯品種葉組織中的HCT基因表達差異分析

二斑葉螨為害后，HCT基因在感螨木薯品種面包和BRA900 中的表達量變化不顯著，在SC205 中顯著下降。而在抗螨木薯品種C1115、緬甸中的表達量先顯著上升而后下降，SC9 中的表達量隨螨害時間延長而逐漸升高（SC9 螨害1 d 除外），其中螨害4 d 后，HCT基因在C1115 中的表達量顯著上升了1.82 倍，在緬甸中顯著上升了1.96 倍，在SC9 中顯著上升了4.72 倍（圖4-A）。相關(guān)性分析結(jié)果表明，木薯品種抗螨性與螨害后HCT基因表達量的升高呈正相關(guān)（R=0.746 4）。進一步比較相同螨害時間內(nèi)抗、感螨木薯品種HCT基因的表達量變化發(fā)現(xiàn)，抗螨木薯品種中HCT的表達量并不一定高于感螨木薯品種（圖4-B）。

圖4 螨害前后不同時間各品種HCT 基因表達量變化Fig. 4 Changes of HCT gene expressions in different varieties at different times before and after mite infestation

2.5 二斑葉螨取食前后抗、感木薯品種葉組織中的CSE基因表達差異分析

二斑葉螨為害后，CSE基因在感螨木薯品種SC205、面包和BRA900 中的表達量均表現(xiàn)出隨為害時間延長而逐漸降低的趨勢（面包螨害1 d 除外），分別下降了47.4%、81.8%和75.5%。而在抗螨木薯品種C1115、緬甸、SC9 中的表達量均表現(xiàn)出隨為害時間延長而逐漸升高的趨勢（緬甸螨害4 d 除外），螨害4 d 后，在C1115 中的表達量顯著上升了1.82 倍，在SC9 中顯著上升了4.72 倍（圖5-A）。進一步比較相同螨害時間內(nèi)不同木薯品種CSE基因的表達量差異發(fā)現(xiàn)，抗螨木薯品種中CSE的表達量并不一定高于感螨木薯品種（圖5-B）。

圖5 螨害前后不同時間各品種CSE 基因表達量變化Fig. 5 Changes of CSE gene expressions in different varieties at different times before and after mite infestation

2.6 二斑葉螨取食前后抗、感木薯品種葉組織中的COMT基因表達差異分析

二斑葉螨為害后，COMT基因在感螨木薯品種面包中表達量變化不顯著，在SC205 和BAR900中表達量顯著下降隨后上升。而抗螨木薯品種C1115、SC9 中 的 表 達 量 顯 著 下 降 了73.5% 和84.9%（螨害1 d），緬甸中的表達量變化不顯著（圖6-A）。進一步比較相同螨害時間內(nèi)抗、感螨木薯品種COMT基因的表達量變化發(fā)現(xiàn)，抗螨木薯品種中COMT的表達量并不一定高于感螨木薯品種（圖6-B）。

圖6 螨害前后不同時間各品種COMT 基因表達量變化Fig. 6 Changes of COMT gene expressions in different varieties at different times before and after mite infestation

2.7 二斑葉螨取食前后抗、感木薯品種葉組織中的CCoAOMT基因表達差異分析

二斑葉螨為害后，CCoAOMT基因在感螨木薯品種SC205、面包中的表達量變化不顯著，在BAR900中顯著下降了43.8%。而在抗螨木薯品種C1115、緬甸、SC9 中的表達量均表現(xiàn)出隨為害時間延長而逐漸升高的趨勢，其中螨害4 d 后，CCoAOMT基因在C1115 中的表達量顯著上升了1.29 倍，在緬甸中顯著上升了1.38 倍，在SC9 中顯著上升了4.96倍（圖7-A）。相關(guān)性分析結(jié)果表明，木薯品種抗螨性與螨害后CCoAOMT基因表達量的升高呈正相關(guān)（R=0.636 5）。進一步比較相同螨害時間內(nèi)抗、感螨木薯品種CCoAOMT基因的表達量變化發(fā)現(xiàn)，抗螨木薯品種的表達量在螨害4 d 后顯著高于感螨木薯品種（圖7-B）。

圖7 螨害前后不同時間各品種CCoAOMT 基因表達量變化Fig. 7 Changes of CCoAOMT gene expressions in different varieties at different times before and after mite infestation

2.8 二斑葉螨取食前后抗、感木薯品種葉組織中的F5H基因表達差異分析

二斑葉螨為害后，F(xiàn)5H基因在感螨木薯品種SC205 中的表達量隨螨害時間顯著上升，在面包和BRA900 中的表達量變化不顯著。而在抗螨木薯品種C1115、SC9 中的表達量均表現(xiàn)出隨為害時間延長而逐漸升高的趨勢，螨害4 d 后分別上升了3.61 倍和4.44 倍，在緬甸中的表達量變化不顯著（圖8-A）。進一步比較相同螨害時間內(nèi)抗、感螨木薯品種F5H基因的表達量變化發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)5H基因雖然在感螨品種SC205 中的表達量顯著上升，但在螨害1 d 后顯著低于抗螨品種，而抗螨木薯品種C115 和緬甸的表達量在螨害4 d 后均顯著高于感螨木薯品種（圖8-B）。

圖8 螨害前后不同時間各品種F5H 基因表達量變化Fig. 8 Changes of F5H gene expressions in different varieties at different times before and after mite infestation

2.9 二斑葉螨取食前后抗、感木薯品種葉組織中的CCR基因表達差異分析

二斑葉螨為害后，CCR基因在不同感螨品種中的表達量變化并無一致性（在SC205 中表達量提高，在面包中顯著減低，在BRA900 中無顯著變化）。而在抗螨木薯品種C1115、緬甸、SC9 中的表達量均表現(xiàn)出隨為害時間延長而逐漸升高趨勢（SC9 螨害4 d 除外），其中螨害4 d 后，CCR基因在抗螨木薯品種C1115、緬甸、SC9 中的表達量顯著上升了2.98 倍、1.1 倍和1.7 倍（圖9-A）。相關(guān)性分析結(jié)果表明，木薯品種抗螨性與螨害后CCR基因表達量的升高呈正相關(guān)（R=0.769 8）。進一步比較相同螨害時間內(nèi)抗、感螨木薯品種CCR基因的表達量變化發(fā)現(xiàn)，抗螨木薯品種的表達量在螨害4 d 后均顯著高于感螨木薯品種（圖9-B）。

圖9 螨害前后不同時間各品種CCR 基因表達量變化Fig. 9 Changes of CCR gene expressions in different varieties at different times before and after mite infestation

2.10 二斑葉螨取食前后抗、感木薯品種葉組織中的CAD基因表達差異分析

二斑葉螨為害后，CAD基因在感螨木薯品種SC205 中的表達量顯著下降，在面包和BRA900 中表達量變化不顯著。而在抗螨木薯品種C1115、緬甸、SC9 中的表達量均表現(xiàn)出隨為害時間延長而逐漸升高的趨勢，其中螨害4 d 后，CAD基因在C1115、緬甸和SC9 中的表達量顯著上升了2.68 倍、1.11 倍和3.07 倍（圖10-A）。相關(guān)性分析結(jié)果表明，木薯品種抗螨性與螨害后CAD基因表達量的升高呈正相關(guān)（R=0.813 7）。進一步比較相同螨害時間內(nèi)抗、感螨木薯品種CAD基因的表達量變化發(fā)現(xiàn)，抗螨木薯品種中CAD的表達量并不一定高于感螨木薯品種（圖10-B）。

圖10 螨害前后不同時間各品種CAD 基因表達量變化Fig. 10 Changes of CAD gene expressions in different varieties at different times before and after mite infestation

3 討論

3.1 作物次生代謝物含量及其調(diào)控基因與作物抗蟲性密切相關(guān)

木質(zhì)素作為植物細胞壁的主要成分，在作物抗蟲中具有重要作用［21］，研究發(fā)現(xiàn)，高粱中阿魏酸含量與其對高粱芒蠅因取食后死亡率呈正相關(guān)，而對香豆酸與之相反［22］。同樣地，在玉米中也發(fā)現(xiàn)阿魏酸濃度與歐洲玉米螟幼蟲生長速率顯著負相關(guān)［23］。研究表明，木質(zhì)素合成途徑基因的表達水平高低，直接影響木質(zhì)素含量積累。調(diào)控木質(zhì)素合成途徑基因的表達水平會影響木質(zhì)素含量，如在轉(zhuǎn)基因煙草中過表達PAL基因，木質(zhì)素含量及PAL的活性均增加［24］；降低轉(zhuǎn)基因楊樹［25］、玉米［26］中CCR的活性，植株中木質(zhì)素含量將會降低甚至降到原來含量的一半；抑制甜蕎［27］、桉樹［28］中CCoAOMT基因的表達，能顯著降低木質(zhì)素含量。本研究發(fā)現(xiàn)，與二斑葉螨取食前相比，抗螨木薯品種中，木質(zhì)素合成途徑基因表達量不僅在螨害后呈顯著上升的趨勢，而且也高于相同螨害時間的表達水平。推測木薯的抗螨性可能與螨害后木質(zhì)素合成途徑基因的表達量顯著提高有關(guān)，這與上述研究結(jié)果具有相似性。

3.2 木質(zhì)素合成通路基因的誘導表達是植物防御害蟲為害的有效途徑

亞麻籽中的木脂素與新木脂素能夠?qū)μ已劣兄苯拥亩竞ψ饔茫?4］，木質(zhì)素含量高的植株通常具有較強的抗性［29-32］。而CCR基因在華中五味子中能夠同時調(diào)控木質(zhì)素與木脂素的含量［33］。同時發(fā)現(xiàn)作物遭受害蟲為害后，其中抗性品種中的木質(zhì)素合成基因的表達水平較高，響應速度較快，如多頭切花菊接種桃蚜后，木質(zhì)素合成基因PAL、F5H的表達量發(fā)生顯著變化，并且相較于感蚜品種，抗蚜品種表達量變化響應更快，上升幅度更大，并導致木質(zhì)素的迅速積累［34］；抗蟲水稻品種受褐飛虱取食后，PAL基因表達量迅速上升且顯著高于感蟲品種［35］；蚜蟲取食后，玉米中PAL、C4H基因的表達量在短時間內(nèi)迅速提高［36］。

通過對木質(zhì)素合成途徑基因表達水平分析發(fā)現(xiàn)，木薯木質(zhì)素合成途徑中C4H、HCT、CSE、F5H、CAD這5 個基因在二斑葉螨為害后，抗、感螨木薯品種中的表達量總體上有所提高，而未保持較高的表達水平，且在相同螨害時間內(nèi)，這5 個基因的表達量在抗、感木薯品種間整體上未表現(xiàn)出顯著差異。與之相反，PAL、4CL、CCoAOMT、CCR基因的表達量在抗螨木薯品種中顯著提高，在感螨木薯品種中顯著降低或無顯著差異，并且在相同的螨害時間內(nèi)，抗螨木薯品種中這4 個基因的表達量普遍高于感螨木薯品種，尤其以螨害4 d 后表達量表現(xiàn)出顯著差異。可以發(fā)現(xiàn)，抗螨木薯品種具有更強的調(diào)控木質(zhì)素合成基因的能力以抵抗螨害，PAL、4CL、CCoAOMT、CCR這4 個基因受螨害4 d 后，在抗螨木薯品種中的表達量均顯著高于感螨木薯品種，其表達量的升高均與木薯抗螨性呈顯著正相關(guān)，推測木質(zhì)素合成途徑基因參與調(diào)控木薯抗螨機制。

3.3 下一步研究展望

本研究僅從木質(zhì)素合成途徑基因轉(zhuǎn)錄水平層面闡述了木薯對二斑葉螨的抗性機制，而二斑葉螨為害前后，木質(zhì)素合成途徑關(guān)鍵酶活性、木質(zhì)素的含量差異變化尚未進行測定，其與基因表達和酶活水平是否具有一致性，及其與木薯品種對二斑葉螨抗性的相關(guān)性尚不明確。此外，本研究發(fā)現(xiàn)表達量顯著變化的4 個基因PAL、4CL、CCoAOMT、CCR均位于木質(zhì)素合成途徑的前端部分，說明木質(zhì)素合成中間體的特化同樣可能參與木薯抗螨性的調(diào)控，上述疑問仍需后續(xù)試驗進一步驗證和解答。

4 結(jié)論

二斑葉螨為害后，抗螨木薯品種中木質(zhì)素合成途徑基因PAL、4CL、CCoAOMT、CCR的表達量顯著高于螨害前水平及相同螨害時間的感螨木薯品種，表明上述4 個基因可能與木質(zhì)素合成途徑介導的木薯抗螨性有關(guān)。