薄荷內(nèi)生細(xì)菌X7 的分離鑒定及其對(duì)番茄黃萎病的防效

張慶琛，劉應(yīng)敏，朱曉琴，韓 霜，黃夢(mèng)晴，裴冬麗

（1.商丘師范學(xué)院生物與食品學(xué)院·河南省特色微生物資源開(kāi)發(fā)與應(yīng)用工程研究中心 河南商丘 476000；2.商丘師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院 河南商丘 476000）

植物內(nèi)生細(xì)菌（Endophyte）是定殖在健康植物組織內(nèi)部，并與植物建立共生關(guān)系的一類微生物[1]。已有研究表明，植物內(nèi)生菌最早發(fā)現(xiàn)于禾本科植物，如牧草等，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)廣泛存在于至少80 個(gè)屬的290 多種禾本科植物中，重要的經(jīng)濟(jì)林木如針葉類（冷杉、云杉、紅杉、松、柏等）、闊葉類（櫟樹、樺樹、桉樹等）、灌木、草本植物以及栽培作物、果樹、藻類和蕨類植物[2]。大量有益的內(nèi)生菌在植物體內(nèi)能產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（內(nèi)生共生固氮）、激素等物質(zhì)，參與植物的代謝過(guò)程，能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)和增強(qiáng)植物抗逆、抗病、抗蟲等能力[3]，這些特性引起了植物學(xué)家、植物生理學(xué)家、植物病理學(xué)家的高度關(guān)注。

薄荷（Mentha canadensis）為唇形科（Lamiaceae）薄荷屬（Mentha）多年生草本中藥材。薄荷中包含多類化合物如精油、多酚類、黃酮類等，被廣泛地應(yīng)用于抑菌[4-5]、抗病[6-7]、抗腫瘤[8]。截止到目前，薄荷內(nèi)生菌的研究主要是內(nèi)生細(xì)菌多樣性及組成分析[9-10]，內(nèi)生真菌篩選及多樣性分析[11-12]，有關(guān)薄荷內(nèi)生菌對(duì)植物促生、生物防治方面的研究鮮有報(bào)道。筆者從薄荷上分離并鑒定內(nèi)生細(xì)菌，分析內(nèi)生菌對(duì)不同病原菌的廣譜抗性，同時(shí)對(duì)獲得的拮抗菌進(jìn)行鑒定，并進(jìn)一步探討拮抗菌對(duì)番茄黃萎病的生物防效及其生理機(jī)制，旨在為微生物菌劑的研發(fā)提供生防菌種和番茄黃萎病生物防治的分子機(jī)制研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、禾谷鐮刀菌（F.graminearum）和黃萎病菌（Verticillium dahliae）由商丘師范學(xué)院植物與微生物互作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，串珠鐮刀菌（F.verticillioides）由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

2020 年5 月對(duì)示范園區(qū)溫室內(nèi)健康無(wú)病的薄荷（Mentha canadensis）進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離，2022年4 月對(duì)室內(nèi)盆栽的Moneymaker 番茄進(jìn)行生物防效相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。薄荷（Mentha canadensis）、Moneymaker 番茄由商丘師范學(xué)院植物與微生物互作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 薄荷內(nèi)生細(xì)菌的分離、純化與形態(tài)學(xué)觀察

將新鮮無(wú)病薄荷的根、莖和葉用流水沖洗，室溫晾干。用75%（φ，后同）乙醇消毒1 min 后無(wú)菌水沖洗5 次，再用2%NaClO 溶液浸泡1 min 后無(wú)菌水沖洗5 次。將消毒后的根、莖、葉分別加適量無(wú)菌水，研磨至勻漿，靜置10 min，吸取100 μL 涂布于溶菌肉湯（LB）固體培養(yǎng)基平板，以最后一次的無(wú)菌水作對(duì)照。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～3 d，用接種環(huán)分別挑取平板中不同形態(tài)、大小、顏色等的菌落，平板劃線純化后獲得單菌落，并對(duì)純化后的單菌落進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.2 薄荷內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選 采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，以5 個(gè)供試菌株為病原菌，挑取病原菌菌餅置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基平板中心，于其周圍同等距離（約距中心2.3 cm）3 處接種待篩薄荷內(nèi)生細(xì)菌，以不接內(nèi)生細(xì)菌作對(duì)照。于28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)，待對(duì)照的病原菌長(zhǎng)滿平板（直徑為9 cm）時(shí)，觀察對(duì)峙平板薄荷內(nèi)生細(xì)菌對(duì)病原菌的抑菌效果；利用病原菌與內(nèi)生細(xì)菌兩點(diǎn)劃線法，測(cè)量對(duì)峙平板的病原菌向內(nèi)生細(xì)菌擴(kuò)展的距離，即處理菌落半徑，并按下列公式計(jì)算抑菌率[13]，每個(gè)薄荷內(nèi)生細(xì)菌對(duì)單一病原菌的抑菌率均由其3 個(gè)對(duì)峙平板計(jì)算，每個(gè)對(duì)峙平板測(cè)定3 個(gè)數(shù)據(jù)，即9 次重復(fù)。經(jīng)篩選獲得拮抗作用較好的菌株做進(jìn)一步試驗(yàn)。

1.2.3 薄荷內(nèi)生拮抗細(xì)菌生理生化鑒定 參照趙詩(shī)佳等[14]的方法對(duì)薄荷內(nèi)生拮抗細(xì)菌菌株進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、吲哚乙酸試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)，參照東秀珠等[15]的方法對(duì)薄荷內(nèi)生拮抗細(xì)菌菌株進(jìn)行乙酰甲基甲醇試驗(yàn)（V-P test）和乳糖、甘油、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)，參照夏明聰?shù)萚16]的方法測(cè)定薄荷內(nèi)生拮抗細(xì)菌菌株生防特性相關(guān)的β-1，3 葡聚糖酶活性和蛋白酶活性。參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[15]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[17]對(duì)薄荷內(nèi)生拮抗細(xì)菌菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.2.4 X7 菌株分子生物學(xué)鑒定 提取拮抗細(xì)菌基因組DNA，利用Mastercycler?nexus PCR 儀對(duì)其16S rDNA 進(jìn)行PCR 分析。所用引物為：fD1（5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3’）和 rP1（5’-TACCTTGTTACGACTT-3’）。PCR 反應(yīng)體系為50.0 μL：模板DNA 50～80 ng、上下游引物（10 μmol · μL-1）各1.0 μL、dNTP 5.0 μL、buffer（Mg2+）0.5 μL、Taq酶0.5 μL、ddH2O 補(bǔ)至50.0 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物通過(guò)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，委托南京金斯瑞生物科技有限公司對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。所測(cè)序列遞交GenBank，并通過(guò)BLASTn 對(duì)測(cè)定16S rDNA 基因序列進(jìn)行同源性分析，利用MEGA 5.0 軟件基于鄰接法（Neighborhood Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 X7 菌株對(duì)番茄黃萎病的生物防效測(cè)定 取健康飽滿的番茄種子消毒后，將番茄按照表1 進(jìn)行3 種不同處理，即對(duì)照組、致病組、防病組。試驗(yàn)采用室內(nèi)盆栽方式，按照表1 傷根法對(duì)長(zhǎng)至5～6 片真葉的番茄植株接種黃萎病病原菌，處理至20 d 調(diào)查番茄的發(fā)病率，并按下列公式分別計(jì)算病情指數(shù)[18]和防治效果，每個(gè)處理3 次重復(fù)，每次重復(fù)10 盆，每盆種植1 株。發(fā)病程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照陸家云等[19]的標(biāo)準(zhǔn)。0 級(jí)：外部無(wú)癥狀，植株健康；1 級(jí)：病葉面積占總?cè)~片的10%以下，葉脈間黃化；2 級(jí)：病斑面積占總?cè)~片的10%～50%，葉脈變黃且萎蔫；3級(jí)：病葉面積占總?cè)~片的50%以上，整株萎蔫；4級(jí)：植株死亡。

表1 X7 菌株對(duì)番茄黃萎病生物防治的處理方式

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0 軟件基于Fisher LSD（最小顯著性差異）法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，采用Excel2019 繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄荷內(nèi)生細(xì)菌的分離、純化與形態(tài)學(xué)觀察

從薄荷根、莖、葉組織中一共分離出25 株內(nèi)生細(xì)菌菌株，根中9 株、莖中8 株、葉中8 株。根據(jù)菌落及菌體形態(tài)學(xué)特征觀察，這25 株菌株被初步劃分為4 個(gè)類型（圖1），分別包含3、6、7、9 株內(nèi)生細(xì)菌菌株。每個(gè)類型選取1 個(gè)菌株分別命名為X3、X6、X7、X9，菌落及菌體形態(tài)特征詳見(jiàn)表2。

圖1 薄荷內(nèi)生細(xì)菌的4 種主要類型

表2 薄荷內(nèi)生細(xì)菌的菌落形態(tài)特征

2.2 薄荷內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，將上述分離純化的不同類型內(nèi)生細(xì)菌菌株進(jìn)行病原菌廣譜抗性篩選。結(jié)果表明，薄荷內(nèi)生細(xì)菌X7 和X9 菌株對(duì)葡萄座腔菌、尖孢鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、黃萎病菌、串珠鐮刀菌5 種供試病原菌均有抑制活性，對(duì)黃萎病菌的抑菌效果最好，抑菌率分別為73.33%、70.62%（表3）；X7 菌株對(duì)5 種病原菌的抑菌率均略高于X9 菌株（圖2，表3），說(shuō)明X7 菌株拮抗活性較高，具有相對(duì)較大的生物防治潛力。

圖2 薄荷內(nèi)生細(xì)菌X7 和X9 對(duì)番茄黃萎病菌的拮抗作用

表3 薄荷內(nèi)生細(xì)菌X7 和X9 對(duì)5 種病原菌的抑菌率 %

2.3 薄荷內(nèi)生拮抗細(xì)菌生理生化鑒定

2.4 X7菌株分子生物學(xué)鑒定

以細(xì)菌基因組DNA 為模板，利用引物fD1/rP1經(jīng)PCR 獲得約1200 bp 的目的片段（圖3），測(cè)序獲得內(nèi)生拮抗細(xì)菌X7 的序列長(zhǎng)度為1163 bp，該序列提交至GenBank 后獲得登錄號(hào)（OM956127）。BLASTn 分析并下載較高同源性的序列，利用MEGA5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖4 可知，X7菌株與貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis（MT013384）聚為一支。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特征的結(jié)果，鑒定薄荷內(nèi)生拮抗細(xì)菌X7 菌株為貝萊斯芽孢桿菌。

圖3 薄荷內(nèi)生拮抗細(xì)菌X7 菌株16SrDNA 的PCR 分析

圖4 基于16S rDNA 序列構(gòu)建的X7 菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.5 X7菌株對(duì)番茄黃萎病的生物防效

采用表1 的處理方法，室內(nèi)盆栽番茄接種黃萎病病原菌20 d 后，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算薄荷內(nèi)生拮抗細(xì)菌X7 對(duì)番茄黃萎病的生物防效指標(biāo)列于表5。對(duì)照組番茄植株均未發(fā)??；致病組的番茄植株幾乎全部發(fā)病，病情指數(shù)達(dá)70.83；拮抗菌X7 產(chǎn)生有活性的β-1，3 葡聚糖酶和蛋白酶（表4）可有效抑制番茄黃萎病菌的正常生長(zhǎng)，防病組番茄植株的發(fā)病率和病情指數(shù)顯著下降，防治效果達(dá)到67.16%。結(jié)果表明，薄荷內(nèi)生拮抗細(xì)菌X7 對(duì)番茄黃萎病的生物防效較好。

表4 薄荷內(nèi)生拮抗細(xì)菌X7 和X9 的生理生化特征

表5 薄荷內(nèi)生拮抗細(xì)菌X7 對(duì)番茄黃萎病的生物防效

3 討論與結(jié)論

筆者的研究共分離獲得25 株薄荷內(nèi)生菌株，經(jīng)抑菌譜篩選獲得2 株薄荷內(nèi)生拮抗細(xì)菌X7 和X9，對(duì)番茄黃萎病的抑菌率分別為73.33%和70.62%，X7 拮抗活性更高；經(jīng)鑒定X7 為貝萊斯芽孢桿菌。基于確立種分類地位較晚[20-21]，貝萊斯芽孢桿菌存在菌種資源保藏量較少的問(wèn)題[22]。已有研究表明，貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）2A-2B[23]能有效拮抗辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、茄病鐮刀菌（F.solani）、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani），抑菌率在60%以上；B.velezensisYP2[24]能 有 效 拮 抗Cercesporaspp.、Septoriasp.、Phomasp.、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）和油菜菌核病菌（Sclerotinia scleotiorum）等真菌。這與筆者研究的貝萊斯芽孢桿菌X7 菌株對(duì)供試真菌病原菌的抑制效果類似，進(jìn)一步證明貝萊斯芽孢桿菌確有抑菌譜廣的特性；筆者獲得的貝萊斯芽孢桿菌X7 菌株豐富了貝萊斯芽孢桿菌菌種資源。

番茄黃萎?。╒.dahliae）是番茄生產(chǎn)特別是保護(hù)地栽培的重要病害之一，嚴(yán)重降低了番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)[25]。前人研究結(jié)果表明，貝萊斯芽孢桿菌能夠有效防治小麥紋枯病[16]、紅葉芥菜白粉病[24]、日本大葉黃楊炭疽病[26]、稻瘟病[27]、松材線蟲[28]、番茄青枯病[29]等，展現(xiàn)出較廣泛的生物防效。筆者研究證明，貝萊斯芽孢桿菌X7 菌株顯著降低了盆栽試驗(yàn)番茄的黃萎病發(fā)病率、病情指數(shù)，生物防效較佳；分析發(fā)現(xiàn)該菌株能夠產(chǎn)生有活性的β-1，3 葡聚糖酶和蛋白酶，這些酶能夠降解病原菌細(xì)胞壁中的β-葡聚糖、蛋白質(zhì)[30-31]，這是貝萊斯芽孢桿菌X7 菌株有效生物防治番茄黃萎病的重要生理機(jī)制之一，有關(guān)其防治番茄黃萎病的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。筆者擬利用致病組和防病組的番茄植株，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組與代謝組的聯(lián)合分析進(jìn)一步探討X7 防治番茄黃萎病的誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性的分子機(jī)制。

筆者的研究結(jié)果表明，從薄荷獲得的貝萊斯芽孢桿菌X7 是一株極具生防菌劑研發(fā)潛力的菌株，可用于番茄黃萎病的防治。同時(shí)，研究結(jié)果可為貝萊斯芽孢桿菌防治番茄黃萎病分子機(jī)制的探討提供材料支撐和理論參考。