不同激素和預處理時間對辣椒花藥培養的影響

程志芳，韓婭楠，董曉宇，常曉軻，姚秋菊

（河南省農業科學院園藝研究所 鄭州 450002）

辣椒（Capsicum annuumL.）屬于茄科辣椒屬蔬菜，為異花授粉植物。按照傳統育種方法，培育一個自交系至少需要5 代，周期長，費時費力，而通過辣椒花藥培養技術僅通過1～2 代即可得到純合二倍體材料，縮短了育種年限，同時提高選擇效率，增加遺傳類型，甚至篩選到突變體[1]。自1964 年印度學者Guha 和Maheshwari[2]通過毛曼陀蘿的花藥培養成功獲得單倍體植株以來，花藥培養獲得突破性進展。1973 年，王玉英等[3]和George 等[4]首次成功獲得了C.annuum辣椒花藥培養的再生植株。之后很多學者對如何提高辣椒花藥培養效率進行了研究。但大多集中在花蕾預處理方法[5-6]、外植體消毒方法[7-8]、培養基選擇[9-12]、碳源選擇[13]和激素組合[13-17]應用上。而在激素組合應用方面多是利用NAA 與KT 組合進行辣椒花藥培養，且許多研究者[13，18-19]認為0.5 mg·L-1NAA 與1.0 mg·L-1KT 組合最適合辣椒花藥培養。另有前人研究表明，2，4-D 和KT 組合在花藥培養中亦可直接誘導出胚狀體[20-21]。而在辣椒花藥培養方面，針對2，4-D 對辣椒花藥培養的影響研究較少。僅有的少量相關研究結果表明[6，22-23]，低濃度的2，4-D 與KT 組合可誘導辣椒花藥產生胚狀體。筆者以15 個不同類型的辣椒品種為試材，采用MS 培養基，比較了不同品種、2，4-D或NAA 與KT 激素組合以及預處理時間對辣椒花藥培養的影響，旨在為提高辣椒花藥培養效率提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

參試的15 個不同類型的辣椒品種見表1。于2020 年1 月底播種，4 月下旬定植于河南省農業科學院現代農業研究開發基地露地試驗區。5 月中下旬至6 月中下旬采摘初花期和盛花期花蕾，上午8：00左右取樣，選取萼瓣等長或花瓣稍露出花萼的花蕾（此時小孢子大部分處在單核靠邊期），4 ℃低溫預處理1～7 d。將經過預處理的花蕾，在超凈工作臺上用70%乙醇浸泡消毒30 s，再用0.1%HgCl2浸泡10 min，無菌水沖洗4～5 次。置于鋪有無菌濾紙的培養皿中，用鑷子和解剖刀剝開花蕾，取出花藥，接種在培養基上，用para-film 封口。32 ℃恒溫暗培養7 d，之后26 ℃下暗培養至有胚狀體長出，將其轉入無任何添加物的MS 培養基，培養條件為26 ℃，光周期為12 h·d-1，直至其分化成苗。

表1 供試辣椒的品種和類型

1.2 試驗設計

試驗采用完全隨機設計方法，探究了品種、激素和預處理時間3 個因素對辣椒花藥培養的影響。每處理2～3 皿，每皿接種30 個花藥，3 次重復。所有試驗以MS 為基本培養基，添加30.0 g·L-1蔗糖，4.0 mg·L-1AgNO3，3.0 g·L-1活性炭和8.0 g·L-1瓊脂，調節pH 值為5.8。

1.2.1 品種篩選 將上述15 個不同類型辣椒品種的花藥接種在m2培養基（MS+1.0 mg·L-12，4-D+1.5 mg·L-1KT）上，篩選出花藥培養效率較高的品種。

1.2.2 不同激素誘導培養基 將前期篩出的高效品種的花藥接種于m1、m2、m3等3 種培養基上。m1、m2、m3等3 種培養基的外源激素種類及其濃度見表2，從中篩選出適用品種較多的高效培養基配方。

表2 培養基中添加的激素種類及濃度

1.2.3 不同預處理時間 以華之秀2 號的花藥為試材，分別經歷1、2、3、4、5、6、7 d 的4 ℃低溫預處理后接種于m3培養基上。

1.2.4 指標測定 接種20 d 后每周調查1 次胚狀體萌發狀況，直至接種后80 d 統計出胚率、成苗率和畸形胚率。對于試驗中出現的類似根毛的胚狀體，轉入MS 培養基后只分化成根或少量的莖，均不能成苗，因此未列為胚狀體進行統計分析。

出胚率/%=（出胚數/接種花藥數）×100；成苗率/%=（成苗數/接種花藥數）×100；畸形胚率/%=[（出胚數-成苗數）/出胚數]×100；根毛胚率/%=（根毛胚個數/接種花藥數）×100。

1.3 數據分析

采用DPS（9.01）軟件進行完全隨機設計單因素試驗方差分析。

2 結果與分析

2.1 品種對辣椒花藥培養的影響

由表3 可知，在參試的15 個辣椒品種中有9個品種出胚，出胚率為0.37%～4.44%，7 個品種成苗，成苗率為0.56%～2.25%。不同品種的出胚率、成苗率、畸形胚率和根毛胚率有一定差異。在出胚率方面，短指椒品種中順808 和PC447 最高，達4.44%；其與華之秀2 號（3.42%）和新時代（2.96%）差異不顯著，但顯著高于其他參試基因型的出胚率。博辣艷麗和無名線椒出胚率均為1.67%，豫園大椒F1和一品特大椒、美辣華之秀出胚率依次降低，而金螺三號、豫園巨椒、豫藝鮮辣128、黃線椒、貴州朝天椒和豐抗二號6 個品種未出胚。在成苗率方面，華之秀2 號成苗率最高，為2.25%，中順808 和PC447 成苗率均為2.22%，3 個基因型之間成苗率差異不顯著，與博辣艷麗（1.67%）和新時代（1.30%）的成苗率差異也不顯著，但顯著高于其他參試基因型的成苗率。豫園大椒F1和一品特大椒成苗率最低，均為0.56%。在畸形胚率方面，博辣艷麗和一品特大椒無畸形胚，全部成苗；華之秀2 號的畸形胚率為34.13%；中順808、PC447 和豫園大椒F1的畸形胚率均為50.00%，新時代畸形胚率為55.56%，而無名線椒和美辣華之秀均為畸形胚。參試的15 個品種中9 個品種誘導出根毛胚，根毛胚率有一定差異，從高到低依次為一品特大椒、豫園大椒F1、新時代、豫園巨椒、華之秀2 號、豫藝鮮辣128、金螺三號、中順808 和美辣華之秀，最高為3.33%，最低為0.37%。綜上，參試的15 個品種中，華之秀2 號、中順808、新時代、PC447 和博辣艷麗5 個品種成苗率較高，且這5 個品種在根毛胚率方面，除新時代較高（2.96%）外，其他4 個品種根毛胚率較低或無根毛胚。由此可知，這5 個品種花藥培養效率最高。

表3 不同品種辣椒花藥培養效率的比較

2.2 不同激素對辣椒花藥培養的影響

由表4 可知，由不同種類及濃度的外源激素組成的3 種培養基對參試5 個辣椒品種花藥培養效率的影響有一定差異。華之秀2 號在3 種培養基上的出胚率和根毛胚率差異均顯著。在出胚率方面，3 種培養基出胚率表現為m3＆gt;m2＆gt;m1。在成苗率方面，m3成苗率最高，m3與m2培養基差異不顯著，但二者均顯著高于m1。m3出胚率、根毛胚率均顯著高于m2，畸形胚率也高于m2，但根毛胚和畸形胚不能成苗。由此可知，m2培養基最適合華之秀2 號進行花藥培養。中順808 在3 種培養基上的成苗率和根毛胚率差異均不顯著，m1出胚率和畸形胚率均與m3差異顯著，但與m2差異不顯著。m1出胚率和成苗率均最高，畸形胚率略低于m2，且3 種培養基上根毛胚率差異不顯著。由此可知，m1培養基最適合中順808 花藥培養。新時代在3 種培養基上根毛胚率和畸形胚率差異均不顯著。m1和m2出胚率均顯著高于m3，但m1與m2差異不顯著；m2成苗率高于m1和m3，且m2與m3差異顯著，但與m1差異不顯著；m2根毛胚率和畸形胚率均最低。由此可知，m2培養基最適合新時代花藥培養。博辣艷麗在3種培養基上出胚率無顯著差異，其中，m1出胚率最高，達2.22%，但成苗率為0.00%，均為畸形胚。m2出胚率雖略低于m1，但成苗率最高，為1.67%，且無畸形胚；3 種培養基上均無根毛胚萌發。由此可知，m2培養基最適合博辣艷麗花藥培養。PC447 在3 種培養基上均無根毛胚萌發，m2出胚率和成苗率分別達4.44%、2.22%，均顯著高于其他2 種培養基。由此可知，m2培養基最適合品種PC447 花藥培養。綜上分析，除中順808 在m1上的辣椒花藥效率較高以外，其他4 個品種均在m2上培養效果最好。由此可知，m2是辣椒花藥培養時適用品種較廣泛的培養基配方。

表4 不同激素組合對不同品種辣椒花藥培養的影響

2.3 不同預處理時間對辣椒花藥培養的影響

由表5 可以看出，將華之秀2 號分別進行1、2、3、4、5、6 和7 d 的4 ℃預處理后接種在m3培養基（出胚率較高）上，預處理時間為3 d 時，由于接種時人為操作不當造成全部污染，故不予統計。其余各處理出胚率、成苗率和根毛胚率均有一定差異，畸形胚率差異不顯著。出胚率和成苗率均呈現出隨預處理時間延長先升高后降低趨勢。預處理2 d 時出胚率和成苗率均最高，分別為10.00%和6.67%，4 d 時出胚率和成苗率顯著降低，當預處理7 d 時出胚率和成苗率均最低，分別為1.11%和0.56%。根毛胚率方面未發現與出胚率和成苗率相似規律，表明預處理時間長短不是根毛胚萌發的主要因素。綜上所述，當花蕾經歷2 d 的4 ℃預處理后，出胚率和成苗率均顯著高于其他預處理時間，培養效果最好。

表5 不同預處理時間對出胚率、成苗率、畸形胚率和根毛胚率的影響

3 討論與結論

筆者研究中參試的15 個不同類型辣椒品種有9 個出胚，出胚率0.37%～4.44%，7 個品種成苗，成苗率0.56%～2.25%。9 個出胚品種中5 個品種花藥培養效率較高，表明品種是影響辣椒花藥培養的重要因素。這與前人[10-11，13，22]的研究結論一致。另外，筆者研究中參試的4 個牛角椒品種3 個出胚，占比為75%，5 個線椒品種3 個出胚，占比60%；4 個短指椒品種2 個出胚，占比50%。表明不同類型辣椒花藥培養誘導出胚概率不同，牛角椒品種較易出胚。這與前人的研究結果類似，戈偉等[18]研究表明牛角椒與辣椒雜種一代為較易出胚品種；趙激等[10]認為大果型品種比小果型品種較易出胚。

辣椒花藥培養中激素種類及其配比一直是眾多學者研究的內容。筆者的研究比較了2，4-D 與KT 組合（m2）、NAA 與KT 組合（m1）以及二者與KT 組合（m3）對辣椒花藥培養的影響，結果表明，MS 培養基中添加1.0 mg·L-12，4-D+1.5 mg·L-1KT（m2）是辣椒花藥培養時適用品種較廣泛的培養基配方。因此，筆者研究認為2，4-D 與KT 組合較NAA 與KT 組合更有助于辣椒花藥培養胚狀體誘導。這與劉獨臣[24]的研究結論一致。但大多相關學者的研究集中在NAA 和KT 的研究[13，18-19]上，且認為NAA 比2，4-D 更適合辣椒花藥培養。分析可能與不同研究中使用基本培養基不同和采用的激素濃度不同有關。已有前人研究[25]表明，在茄子花藥培養方面，低濃度2，4-D 促進胚狀體產生，高濃度2，4-D 促進愈傷組織產生。而在辣椒花藥培養方面，前人[6，22，23]研究表明，0.005～0.100 mg·L-12，4-D與0.05～0.10 mg·L-1KT 組合有利于誘導辣椒花藥產生胚狀體。而筆者研究表明，高濃度2，4-D 和KT組合（1.0 mg·L-12，4-D+1.5 mg·L-1KT）亦可廣泛用于誘導辣椒花藥產生胚狀體。這在劉獨臣[24]的研究中也有類似結論，且其研究表明，高濃度2，4-D 和KT 可促進出胚率較高的品種較快出胚，同時刺激在低濃度時不出胚的品種出胚。這表明高濃度的2，4-D 和KT 組合在不同作物的花藥培養中效果不同。

花藥接種前進行低溫預處理能顯著延長花藥壁和花粉的退化時間，同時在花藥壁中積累大量淀粉，為花粉的進一步發育提供營養[6]。筆者研究表明，4 ℃低溫預處理2 d 時，花藥培養效率最高，這與前人[13-14，26]的研究結論一致，但張天翔等[27]研究表明4 ℃低溫預處理24 h 效果最好。有學者[6]認為4 ℃低溫預處理3～5 d 對胚狀體的形成有較好的促進作用，但也有研究者發現[5]，低溫預處理對辣椒花藥胚誘導無任何促進作用，這可能是由于各個研究的采蕾季節和花期不同。因此，針對不同季節的辣椒花藥培養影響因素有待進一步研究。

筆者研究表明，品種是影響辣椒花藥培養的重要因素；MS 培養基中添加1.0 mg·L-12，4-D、1.5 mg·L-1KT、4.0 mg·L-1AgNO3、3.0 g·L-1活性炭和30.0 g·L-1蔗糖較普遍適用于辣椒花藥培養胚誘導；4 ℃低溫預處理2 d 時最有利于辣椒花藥培養。