微生物利用一碳底物生產單細胞蛋白研究進展

傅曉瑩，喬瑋博，史碩博*

（北京化工大學 北京軟物質科學與工程高精尖創新中心，北京 100029）

世界人口持續增長、人們消費模式變化和氣候變暖給高蛋白食品的生產供應帶來了巨大的挑戰[1]。目前蛋白質類食品的主要來源是動物、植物，其中動物蛋白的生產周期長、耗費大量勞動力資源，生產效率較低，且在動物飼養過程中還會產生CH4等溫室氣體；而植物種植占地面積大、耗水量多，受氣候變化影響較大，且植物蛋白缺乏甲硫氨酸、賴氨酸等人類必需氨基酸，營養價值低[2-3]。預計到2050年，傳統農業將無法滿足人類對高蛋白膳食的需求[4]。事實上，由于食物分配不均，許多人目前無法獲得高質量的蛋白質，導致營養不良，尤其是在發展中國家該問題更為常見[5]。因此，需要開發新型高質量蛋白質來保障食品蛋白供給安全。

微生物具有高水平的蛋白質含量，可以合成人體所需的必需氨基酸，在生物反應器中部分微生物蛋白質的產量可以達到每立方米每小時數千克，這比傳統農業高出幾個數量級，且對環境的影響以及依賴極小[6-7]。微生物單細胞蛋白不僅蛋白質含量高，還含有糖類、脂質、維生素、無機鹽和一些重要的氨基酸，營養價值高，可作為食品工業的新型替代蛋白[8]。與植物和動物蛋白生產相比，微生物單細胞蛋白生產周期短，能源利用效率高，只需小部分土地，且不受天氣和氣候變化的影響。第一次世界大戰期間，德國曾用酵母蛋白取代了一半的進口蛋白質來源[7]。目前全球已有幾家公司在以商業規模生產來自藻類、真菌或細菌的單細胞蛋白，并出售給人們食用。微生物生產單細胞蛋白的底物來源廣泛且價格低廉，包括一碳化合物、工業和農業廢棄物等[4]。因此，食用微生物蛋白具有替代傳統的食物和飼料供應方式的潛力。

微生物可以利用多種底物生產蛋白[4]，其中利用一碳化合物高效生產單細胞蛋白受到廣泛關注。一碳化合物是指具有單個碳原子的化合物，包括CO、CO2、CH4、甲醇、甲醛和甲酸。這些一碳底物來源廣泛、制備簡單、價格低廉且儲量豐富，被認為是生物煉制的新型和長期可持續的原料[9-11]。微生物利用一碳化合物生產單細胞蛋白，不僅可以拓展食品蛋白的供給體系，還可以促進一碳資源的清潔利用，助力我國“雙碳”目標的實現[11]。目前利用一碳化合物生產單細胞蛋白的天然微生物種類主要包括甲基營養菌、化能自養菌和光能自養菌。隨著合成生物學的最新進展和一碳利用途徑的揭示，天然一碳利用微生物的碳利用途徑被優化[12]，且一些原本不能利用一碳化合物的異養菌也被開發利用一碳底物[13-14]。

綜上，利用一碳化合物合成微生物蛋白的生產過程綠色低碳，具有廣闊的應用前景。本文首先介紹微生物單細胞蛋白在食品中的應用及安全性；然后論述近年來天然微生物利用一碳化合物綠色生產單細胞蛋白的研究進展；同時，闡述天然一碳利用微生物的代謝機制以及相關途徑的優化改造；最后對利用合成生物學方法改造微生物生產單細胞蛋白的前景進行展望。

1 微生物單細胞蛋白在食品領域的商業化發展及安全性評價

微生物單細胞蛋白是利用不同的原料培養真菌、細菌或微藻獲得的微生物菌體蛋白。單細胞蛋白中蛋白質含量高，富含人類所需的必需氨基酸，可補充人體所需營養，去除核酸后可作為食品蛋白直接食用。與動物蛋白和植物蛋白相比，單細胞蛋白生產周期短、原料來源廣、能源利用率高，且對環境的影響和依賴性很小，可作為動植物蛋白食品的替代來源[2,4]。單細胞蛋白還含有多種維生素、不飽和脂肪酸和無機鹽，營養價值高，可用于生產功能性食品。此外，鑒于單細胞蛋白良好的水合性、膠凝性、乳化性和組織成型性等功能特性，其亦可作為食品添加劑應用于食品加工[15-16]。

1.1 單細胞蛋白在食品工業中的應用

微生物單細胞蛋白的蛋白質含量高，含有多種維生素和無機鹽，是一種理想的食品蛋白質來源。單細胞蛋白具有良好的組織成型性可用于生產“人造肉”等新食品[17]，Marlow Foods公司利用絲狀鐮刀菌（Fusarium venenatum）制成單細胞蛋白產品Quorn，該產品主要用于生產香腸肉餅、即食漢堡等，目前在全球15 個國家進行商業化生產[16]。單細胞蛋白含有豐富的必需氨基酸、維生素和無機鹽，可作為營養強化劑添加至餅干、飲料和奶制品中，提高食品的營養價值[17-18]。此外，微藻單細胞蛋白含有豐富的不飽和脂肪酸，其中二十二碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是人體必需的脂肪酸，目前利用微藻生產的不飽和脂肪酸已作為營養保健食品銷售[19]。

微生物單細胞蛋白還可作為多種食品添加劑，用于食品加工。酵母濃縮蛋白具有顯著的鮮味，已被廣泛用于醬汁、肉汁等食品的增味；新鮮酵母和活性干酵母可作為發酵劑，用于饅頭、面包的加工；此外，酵母細胞壁多糖β-葡聚糖可作為乳化穩定劑用于乳制品加工[15,20]。利用單細胞蛋白良好的水合性，將其用于肉制品和焙烤食品的制作，可減少加工過程中水分的流失，保持食品良好的口感和風味[17,20]。微藻單細胞蛋白中含有豐富的色素，可生產食用天然色素。微藻單細胞蛋白還富含天然抗氧化劑，包括類胡蘿卜素、酚類化合物、維生素和植物甾醇等，可用于食物保存[21]。有研究表明，添加微藻單細胞蛋白可顯著提高魚肉對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的清除能力，延緩脂肪氧化，延長肉制品保質期[22]。

目前用于商業生產的微生物單細胞蛋白包括好氧甲烷氧化菌（Methylococcus capsulatus）單細胞蛋白[4]、絲狀鐮刀菌單細胞蛋白[16]、用于功能性食品生產的小球藻（Chlorella vulgaris）單細胞蛋白[23]、用于含β-胡蘿卜素的食品添加劑或保健品生產的杜氏鹽藻（Dunaliella salina）單細胞蛋白[24]和用于含蝦青素的保健食品生產的雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）單細胞蛋白等[25]。

1.2 單細胞蛋白應用于食品的安全性

安全性是單細胞蛋白能否作為食品生產原料首先要考慮的問題。影響單細胞蛋白安全性的因素包括微生物生產原料的安全性、單細胞蛋白的RNA含量、微生物本身是否產生毒素以及潛在的過敏原等[4]。相關研究人員討論了單細胞蛋白安全性并指出：生產單細胞蛋白菌株不能是病原菌，菌株不產生毒素；生產原料中重金屬殘留含量不能超過要求；在微生物培養和產品處理中要求無污染、無溶劑殘留和熱損害；最終產品應無病菌、無活細胞、無溶劑殘留；單細胞蛋白產品必須進行動物毒性實和致癌實驗，還要進行人體臨床試驗，測定人體對單細胞蛋白的耐受性和可接受性，才能用于食品生產[26-27]。

微生物具有自身代謝的特點，為了使單細胞蛋白符合作為食物的要求，通常采用特定的后處理來提高這種產品的消化性和可接受性[16]。微藻細胞具有細胞壁，生產微藻單細胞蛋白時需要將細胞壁破碎，使單細胞蛋白更容易被人體消化。細菌和真菌等微生物生長快速，其細胞含有高含量核酸，這致使相應微生物單細胞蛋白或多或少都含有部分核酸，尤其是RNA[8]。當單細胞蛋白用于食品生產時，高核酸含量是一個問題。人體攝入RNA分解產生的嘌呤化合物會增加血漿中的尿酸濃度，而人體缺乏尿酸酶，尿酸會在體內積累，積累過多甚至會導致腎結石和痛風。因此，利用單細胞蛋白生產食品蛋白時，需要增加核酸脫除環節，添加核糖核酸酶使RNA降解，將核酸含量減小到規定的限值以下[4,28]。

細菌在生長過程中會產生有害毒素，細菌產生的毒素分為外毒素和內毒素，在將非致病菌用于單細胞蛋白生產前，需要進行毒素去除。外毒素由細菌分泌到細胞外的培養基中，外毒素的主要成分為蛋白質，化學性質不穩定，60 ℃處理30 min即可破壞，還可通過乙醇、甲醛或稀酸處理使其變性或者脫毒成為類毒素；內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁的組成成分，也稱脂多糖，其去除較為困難，需160 ℃處理2～4 h才可被破壞，因此可通過基因工程手段抑制脂多糖形成基因的活性避免生成脂多糖[4,28]。微生物單細胞蛋白會存在一些潛在的過敏原，可以通過物理、化學或生物方法對其進行處理，從而降低或消除致敏性[29]。為了提高消費者對微生物單細胞蛋白的心理可接受度，單細胞蛋白產品還需加工成一定的結構和形狀再供消費者食用。

2 天然微生物利用一碳化合物生產單細胞蛋白

目前利用一碳化合物生產單細胞蛋白的天然微生物主要包括甲醇酵母、化能自養菌和光合自養微生物三大類。其中甲醇酵母以甲醇為底物，生產的單細胞蛋白中蛋白質含量較高，富含必需氨基酸和維生素，且酵母菌體較大易于分離回收[20]。化能自養菌生長速度快，包括乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum）和好氧甲烷氧化菌等，其中乙醇梭菌以CO為底物，而好氧甲烷氧化菌以CH4為底物，利用它們生產的單細胞蛋白不僅蛋白質和必需氨基酸含量高，還具有較高的消化吸收率，但單細胞蛋白核酸含量較高[8]。光合自養微生物包括微藻和光合細菌兩類，二者均以CO2為底物。微藻光合固碳效率較高，生產的單細胞蛋白富含葉綠素、維生素和不飽和脂肪酸，且核酸含量較低，但微藻細胞壁不易消化[21]；光合細菌單細胞蛋白含有豐富的必需氨基酸、類胡蘿卜素、維生素和聚羥基脂肪酸酯，可用于生產功能性食品[30]。

2.1 甲醇酵母單細胞蛋白

甲醇酵母是一種重要的甲基營養酵母，包括巴斯德畢赤酵母（Komagataella pastoris）、多形漢遜酵母（Ogataea polymorpha）和博伊丁假絲酵母（Candida boidinii）等，這類酵母通過木酮糖單磷酸（xylulose monophosphate，XuMP）途徑以甲醇為碳源進行生長[31]。在甲醇酵母中，甲醇首先在醇氧化酶的作用下氧化生成甲醛，然后甲醛和5-磷酸木酮糖（xylulose 5-phophate，Xu5P）反應，生成的3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮進入糖酵解途徑參與細胞代謝[32]。甲醇酵母細胞利用甲醇生成甲醛的過程在過氧化物酶體中進行，這有利于降低甲醛對細胞的毒性，從而提高細胞生長速度[10]。甲醇是一種清潔能源，價格低廉且來源充足，利用甲醇為碳源是甲醇酵母用于單細胞蛋白生產的優勢，甲醇利用效率決定了其蛋白生產過程的經濟性。甲醇酵母培養結束后，培養液經離心、脫水干燥即可得到甲醇酵母單細胞蛋白（圖1A）。甲醇酵母中蛋白質含量較高，且富含必需氨基酸、維生素和金屬離子，最初被用于生產單細胞蛋白，但甲醇酵母對甲醇的利用效率較低，且甲醇對細胞有一定的毒性[20,31]，與動物和植物蛋白相比，甲醇酵母單細胞蛋白生產成本較高、經濟性較差，因此研究人員轉而開發甲醇酵母生產重組蛋白[33]。目前甲醇酵母是生產重組蛋白的一種重要平臺微生物，已有超過5 000 種重組蛋白使用甲醇酵母生產[34-35]。

2.2 化能自養微生物單細胞蛋白

2.2.1 乙醇梭菌單細胞蛋白

乙醇梭菌是一種厭氧的化能自養菌，它通過Wood-Ljungdahl途徑利用CO或CO2作為碳源，以H2作為還原劑，生產燃料乙醇、微生物蛋白等高附加值化學品[36-38]。乙醇梭菌等化能自養菌的發酵過程與現有工業發酵技術的相容性較好，是構建一碳氣體生物轉化細胞工廠的理想微生物之一。乙醇梭菌已通過中國工業微生物菌種保藏管理中心鑒定，經微生物藥敏試驗、菌種毒力試驗、抗生素基因及致病基因檢測分析證實乙醇梭菌安全無毒，可作為食品工業菌體蛋白的生產菌種[39-40]。

北京首朗生物科技有限公司和中國農業科學院飼料研究所以鋼鐵工業尾氣中的CO為碳源、氨水為氮源，利用梭菌液態厭氧發酵工藝，實現22 s快速高效產出乙醇和乙醇梭菌蛋白。目前該成果已實現工業化，達到了生物合成乙醇梭菌蛋白年產萬噸級的工業生產能力[41]。CO發酵乙醇醪液經蒸餾除乙醇后還含有較多的菌體蛋白，該研究人員根據乙醇梭菌發酵醪液的特性，開發了完整的乙醇梭菌蛋白生產工藝（圖1B）：首先控制乙醇梭菌發酵醪液的pH值和溫度，使菌體蛋白變性沉降；隨后經離心濃縮，并添加絮凝劑后混合均勻，再進行壓濾脫水；產生的濾餅經干燥、粉碎后得到乙醇梭菌蛋白粉。該蛋白干粉的粗蛋白質量分數達到80%以上、粗灰分質量分數不超過7%[37]。乙醇梭菌單細胞蛋白產品的消化率較高，且富含必需氨基酸，目前主要應用于生產動物飼料[41-42]，該產品中核酸含量較高，需要在生產工藝中添加去除核酸的環節，具有開發成新型替代食品蛋白的潛力。

2.2.2 好氧甲烷氧化菌單細胞蛋白

全球產生的CH4氣體在進入大氣前，有很大一部分會被甲烷氧化菌氧化代謝。好氧甲烷氧化菌對于減少大氣中CH4含量、減緩溫室效應具有重要作用[43]。好氧甲烷氧化菌在自然界中分布廣泛，根據細菌結構和進化發育關系可分為3 種類型，分別屬于變形菌門（Proteobacteria）γ亞型、α亞型和疣微菌門（Verrucomicrobia）。變形菌門的好氧甲烷氧化菌首先利用自身的甲烷單加氧酶將甲烷氧化為甲醇，甲醇再經甲醇脫氫酶催化氧化生成甲醛。隨后，變形菌門γ亞型的好氧甲烷氧化菌通過核酮糖單磷酸（ribulose monophosphate，RuMP）途徑將甲醛進一步轉化利用，變形菌門α亞型的好氧甲烷氧化菌則將甲醛轉化為甲酸后進入絲氨酸循環[44]。疣微菌門的好氧甲烷氧化菌是先將甲烷轉化成CO2，再通過Calvin-Benson-Bassham（CBB）循環將CO2轉化利用[45]。

好氧甲烷氧化菌生長速率較高，利用該菌生產的單細胞蛋白純度高，單細胞蛋白作為胞內產物，其生產能力與好氧甲烷氧化菌生長水平密切相關。微生物的比生長速率在很大程度上由培養環境決定[46]，而底物CH4氣體在水中溶解度較低，因此好氧甲烷氧化菌發酵培養時的氣液傳質速率嚴重影響了其對CH4的轉化利用。使用強制環流發酵罐（forced circulation loop reactor，FCLR）以連續培養方式進行好氧甲烷氧化菌發酵，不僅強化了氣液傳質，還保持了較高的單細胞蛋白生產效率。好氧甲烷氧化菌的菌體較小，離心過程能耗較大，且該菌單細胞蛋白的核酸含量較高，需經過核酸去除，再進行干燥、成型，最終得到可供人類食用的好氧甲烷氧化菌單細胞蛋白[43]。

丹麥UniBio和美國Calysta公司分別開發了利用變形菌門γ亞型好氧甲烷氧化菌通過RuMP途徑將CH4轉化為單細胞蛋白的發酵技術。UniBio公司使用帶有靜態混合器的U形環流發酵罐，其單細胞蛋白生產效率達到4 kg/（m3·h），且產品UniProtein?蛋白質量分數達72%[4]。該產品為自由流動的紅棕色顆粒，不含毒素和重金屬，具有較長的保質期，可進一步用于新型替代食品蛋白的開發研究。美國Calysta公司的最新產品Positive Protein單細胞蛋白使用其專利發酵平臺制成。如圖1C所示，該平臺建立了一種循環的蛋白質生產系統，甲烷氧化菌發酵過程中產生的CO2會被系統捕獲，經過甲烷化再進入發酵罐中。Positive Protein蛋白質的可消化率較高，還含有豐富的支鏈氨基酸，可與優質的動物蛋白質相媲美，能夠作為一種營養又健康的食品替代蛋白，用于多種人類食品的生產[47]。

2.3 光能自養微生物單細胞蛋白

2.3.1 微藻單細胞蛋白

微藻是重要的光合固碳微生物，它通過CBB循環將CO2轉化為3-磷酸甘油醛進入中心碳代謝。微藻在光合作用的光反應階段利用葉綠素將H2O分解成氧氣，并產生ATP和還原力NADPH，在暗反應階段利用光反應產生的ATP和NADPH將CO2同化為有機物用于自身生長[9]。微藻生長速率較快，其蛋白質量分數高達70%，是單細胞蛋白的重要來源。微藻單細胞蛋白含有較多葉綠素、維生素和不飽和脂肪酸（EPA和DHA），且核酸含量較低，具有生產功能性高蛋白食品的潛力[21]。

微藻生產單細胞蛋白的效率受CBB循環中CO2捕獲酶的影響較大，利用合成生物學方法提高CO2捕獲酶的效率可有效提高微藻光合固碳能力，從而提升微藻單細胞蛋白的生產能力[9]。1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，RuBisCO）是CBB循環中的關鍵碳捕獲酶，Wei Li等[48]在Nannochloropsis oceanica中過表達了內源的RuBisCO活化酶，通過提高RuBisCO的表達量，使得微藻生長速率提高了32%，生物質積累量提高了46%，從而增強了微藻單細胞蛋白生產能力。光生物反應器（photobioreactor，PBR）對于微藻培養十分重要，它決定著微藻細胞的生長速率和CO2利用效率，進而決定單細胞蛋白的生產效率。PBR分為開放式和封閉式兩大類。開放式PBR包括自然池塘、人工跑道池塘等，它們結構簡單、成本低、操作方便，但易受環境和氣候的影響，光照、溫度的可控性差，還容易遭受雜菌污染。開放式PBR以太陽光為光源，由于太陽光的穿透能力有限，微藻開放培養多為單層跑道池塘的淺水養殖[49-50]。封閉式PBR的光源包括外置光源和內置光源，微藻培養時的溫度、pH值、CO2供應量和光照都可控制，光能利用效率高、微藻培養密度大，但生產成本較高。封閉式PBR包括柱式、管式和平板式反應器等，多用于實驗室規模的微藻培養，放大培養較為困難[50-51]。

微藻種類較多，可以根據生產需求選擇不同的藻株，小球藻蛋白含量較高可用于生產單細胞蛋白。Pan Minmin等開發了一種新型的三室小球藻生物電化學反應器，可以實現清潔培養小球藻和處理工業有機廢水同時進行。該研究為利用工業廢水清潔生產微藻蛋白提供了一種方法[52]。杜氏鹽藻（Dunaliella salina）、雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）等蛋白質含量較低，可用于生產類胡蘿卜素、蝦青素、維生素、極性脂質和甘油等高附加值產品[24-25,53]。微藻大多具有堅硬的細胞壁，人體很難消化，微藻培養后需對其進行細胞破碎來提高微藻單細胞蛋白的消化率，得到的微藻細胞裂解物經過干燥，即可獲得微藻單細胞蛋白（圖1D）[51]。

2.3.2 紫色光合細菌單細胞蛋白

紫色光合細菌是一種厭氧的光合細菌，它通過細菌葉綠素（bacteriochlorophylls，BChls）吸收近紅外光，再利用自身豐富的類胡蘿卜素吸收可見光。紫色光合細菌包括紫色硫細菌和紫色非硫細菌兩類，它們通過CBB循環實現CO2的利用。紫色光合細菌不僅可以CO2為碳源進行光合自養生長，還可分解利用食品工業廢水的有機碳、氮、磷進行異養生長，收集的紫色光合細菌生物質可用于生產單細胞蛋白[30,54]。

紫色光合細菌生長需要充足的光照，由于透光率與細胞密度成反比關系，單位體積的紫色光合細菌細胞產量往往維持在較低水平，因此利用紫色光合細菌生產單細胞蛋白的重要挑戰是降低生產成本，提高生產效率[55]。紫色光合細菌經過厭氧培養后，將培養液離心收集細胞，再去除核酸得到菌體蛋白，經過脫水干燥后即可獲得紫色光合細菌單細胞蛋白（圖1E），目前紫色光合細菌的培養包括開放體系和封閉體系兩類。開放式培養體系（如跑道池塘）具有低成本、操作簡單、易清洗和低能耗的優點，但易受天氣影響，因而難以實現紫色光合細菌長期穩定的生長，且存在生產效率低和易受到其他微生物污染等問題。封閉培養體系（如管式/平板式PBR）具有光照表面積大、氣液傳質速率高、生產強度高、不易受到污染等優勢，但培養成本較高[49]，其中平板式PBR應用比較廣泛[56]。

圖1 天然微生物利用一碳底物生產單細胞蛋白的工藝流程Fig.1 Flow chart for the microbial production of SCPs from single carbon substrates

紫色光合細菌單細胞蛋白的蛋白質含量高，含有豐富的必需氨基酸、類胡蘿卜素、維生素和聚羥基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoates，PHA），營養價值較高，可用于研究開發功能性食品。目前紫色光合細菌單細胞蛋白主要用于生產飼料，而在食品工業中的應用報道較少，且紫色光合細菌單細胞蛋白商業化生產還處于早期階段，需進一步研究開發新型紫色光合細菌PBR，使其具備穩定的高生產強度，同時降低生產成本[30]。

不同種類微生物利用一碳底物合成單細胞蛋白的特性如表1所示。

表1 不同種類微生物利用一碳底物合成單細胞蛋白的比較Table 1 Comparison of SCP synthesis by different microbial species utilizing single carbon substrates

3 天然一碳利用微生物的代謝網絡

天然微生物具有豐富的一碳代謝網絡，利用這些代謝途徑可以實現一碳化合物生產單細胞蛋白。但目前天然微生物的一碳利用效率較低，需要利用合成生物學手段對一碳代謝網絡進行分析和改造，以提高微生物一碳利用效率。這樣不僅可以高效生產單細胞蛋白，而且有效減少碳排放，助力“雙碳”目標的實現[10-11]。當前主要的一碳代謝途徑包括以下種類。

3.1 RuMP和XuMP途徑

RuMP途徑存在于甲基營養細菌中，例如甲醇芽孢桿菌和甲基營養型嗜甲基菌；而XuMP途徑主要存在于甲基營養酵母中，包括畢赤酵母（Pichia pastoris）、多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha）和博伊丁假絲酵母（Candida boidinii）[57]。RuMP、XuMP途徑十分相似，都是甲醛結合戊糖進行碳原子重排，一碳分子后續經由糖酵解途徑進入中心碳代謝，而戊糖的再生保證循環的持續運轉，這兩個途徑的主要區別在于甲醛進入磷酸戊糖途徑的方式。在RuMP途徑中，甲醛在己糖磷酸合成酶（hexulose phosphate synthase，HPS）催化下可以與5-磷酸核酮糖（ribulose 5-phophate，Ru5P）結合生成6-磷酸己酮糖（hexulose 6-phosphate，H6P），然后在磷酸己糖異構酶（phosphohexulose isomerase，PHI）的作用下發生異構化，生成6-磷酸果糖（fructose 6-phosphate，F6P）進入中心碳代謝（圖2A）。在XuMP途徑中，在二羥丙酮合成酶（dihydroxyacetone synthase，DAS）的作用下，Xu5P的糖醛基團轉移到甲醛上，生成3-磷酸甘油醛和二羥丙酮，二羥丙酮可利用二羥丙酮激酶（dihydroxyacetone kinase，DHAK）進一步轉化為磷酸二羥丙酮（dihydroxyacetone phosphate，DHAP），從而進入中心代謝（圖2B）[10]。

3.2 CBB循環

CBB循環是廣泛存在于光合自養和化能自養微生物的一碳利用途徑，包括微藻、藍細菌、光合細菌和甲烷氧化菌等[11]。CBB循環的關鍵酶是RuBisCO，它催化CO2親電加成到烯二醇形式的1,5-二磷酸核酮糖（ribulose 1,5-bisphosphate，RuBP），產生不穩定的C6中間體。C6中間體之后自發水解成兩個3-磷酸甘油酸分子，在ATP水解驅動下再由NADPH進一步還原為3-磷酸甘油醛（圖2C）。CBB循環生成1 個3-磷酸甘油醛分子需要消耗9 個ATP分子和6 個NADPH分子，能量利用效率較低，其關鍵酶RuBisCO的催化效率低且對底物CO2專一性差[58]。優化其關鍵酶可以提高CO2利用效率，如Dur?o等通過過表達輔助RuBisCO折疊的GroEL/ES伴侶蛋白基因和敲除用于RuBisCO組裝的RbcX伴侶蛋白基因，將RuBisCO的CO2羧化效率提高了大約3 倍[59]。

圖2 基于戊糖磷酸途徑的天然一碳利用途徑Fig.2 Pathways for the utilization of natural single carbon compounds based on pentose phosphate pathway

3.3 絲氨酸循環

甲烷氧化菌等許多甲基營養菌可以通過絲氨酸循環來代謝利用甲烷、甲醇、甲醛和甲酸。如圖3A所示，甲酸通過多步催化反應首先生成活性中間體——5,10-亞甲基-四氫葉酸，在絲氨酸羥甲基轉移酶（serine hydroxymethyltransferase，SHMT）的作用下，5,10-亞甲基-四氫葉酸將其一碳單元轉移至甘氨酸從而生成絲氨酸，并經后續多步催化被依次轉化為丙酮酸、草酰乙酸、蘋果酸等重要中間體，蘋果酸則與輔酶A反應生成蘋果酰輔酶A，再進一步生成乙醛酸和乙酰輔酶A，乙酰輔酶A作為重要的中心代謝產物可進入后續代謝途徑中。絲氨酸循環生成1 分子乙酰輔酶A理論上需要消耗2 分子ATP和3 分子NADPH，還原力和ATP消耗較少。絲氨酸循環與中心碳代謝通路有較多重疊，因此在對該循環進行人工改造時需要考慮如何減少中心代謝通路的干擾[60]，如Yu Hong等[61]通過引入絲氨酸脫水酶實現絲氨酸一步生成丙酮酸，改造了天然的絲氨酸循環。新的絲氨酸循環反應步驟較少，并且消除了影響甲酸利用效率的副反應。

3.4 Wood-Ljungdahl途徑

Wood-Ljungdahl途徑（也稱還原性乙酰輔酶A途徑）可將CO2和甲酸轉化為乙酰輔酶A進入中心碳代謝，該途徑需要金屬離子和鐵氧還蛋白的參與。還原性乙酰輔酶A途徑的關鍵酶包括一氧化碳脫氫酶、甲酸脫氫酶和亞甲基呋喃脫氫酶，這些關鍵酶對氧敏感，該通路主要存在于化能自養厭氧微生物中，包括產乙酸菌（如楊氏梭菌（Clostridium ljungdahlii））和產甲烷菌[11,62]，其中產乙酸菌通過H2或NADPH提供還原力，而產甲烷菌利用金屬還原劑提供還原力。Wood-Ljungdahl途徑固定1 分子CO2僅需要消耗1 分子ATP和2 分子NADPH，是一種能源利用效率高、生物質產量高的一碳利用途徑[63]（圖3B）。調控該途徑關鍵酶的表達可顯著提高微生物合成單細胞蛋白的效率。Straub等在伍氏醋酸桿菌（Acetobacterium woodii）中選擇性過表達了Wood-Ljungdahl途徑中4 個關鍵酶的基因和與ATP生成相關的兩個基因，提高了伍氏醋酸桿菌的生長速率[64]。

圖3 基于5,10-亞甲基-四氫葉酸同化的天然一碳利用途徑Fig.3 Pathways for the utilization of natural single carbon compounds based on 5,10-methylenetetrahydrofolate assimilation

3.5 圍繞乙酰輔酶A到琥珀酰輔酶A的一碳利用途徑

還原性三羧酸（reductive tricarboxylic acid，rTCA）循環、二羧酸/4-羥基丁酸（dicarboxylate/4-hydroxybutyrate，DC/HB）循環、3-羥基丙酸/4-羥基丁酸（3-hydroxypropionate/4-hydroxybutyrate，HP/HB）循環和3-羥基丙酸（3-hydroxypropionate，3-HPA）雙循環是圍繞兩種常見的代謝物乙酰輔酶A和琥珀酰輔酶A演化而來，并且每個循環與該組中的另一個循環共享多個反應[65]。

rTCA循環通過逆轉三羧酸循環固定了2 分子CO2，它主要存在于變形菌、綠硫細菌和水生細菌中[28]。rTCA循環利用鐵氧還蛋白和NADPH作為電子供體，該循環生成1 分子乙酰輔酶A需要消耗2 分子ATP，耗能較少[58]。rTCA循環的關鍵步驟是檸檬酸分解成乙酰輔酶A和草酰乙酸。一直以來認為，該檸檬酸分解反應由可逆的ATP依賴性檸檬酸裂合酶（adenosine triphosphate dependent citrate lyase，ACL）催化或者由檸檬酰輔酶A合成酶和檸檬酰輔酶A裂解酶催化的兩步反應來代替，直到2018年才在乙酸脫硫桿菌中發現了具有可逆活性的檸檬酸合酶，該酶不僅能夠催化乙酰輔酶A和草酰乙酸生成檸檬酸，還可以催化檸檬酸分解反應，為該途徑的優化提供了新的思路[66-67]。

圍繞乙酰輔酶A到琥珀酰輔酶A的一碳利用途徑如圖4所示。

圖4 圍繞乙酰輔酶A到琥珀酰輔酶A的天然一碳利用途徑Fig.4 Pathways for the utilization of natural single carbon compounds with transformation from acetyl-CoA to succinyl-CoA

4 結語

作為一種新型食品蛋白，微生物單細胞蛋白不僅蛋白質含量高，還含有糖類、脂質、維生素、無機鹽和必需氨基酸，具有很高的營養價值。目前發展和應用單細胞蛋白已經成為全球廣受關注的食品創新領域，許多企業和組織將業務聚焦于單細胞蛋白生產，將其轉化為更可口、更營養的食品原料，不斷豐富和改善人類食品[70]。其中，微生物利用一碳化合物生產單細胞蛋白，不僅原料來源廣、生產周期短、生產設備占地面積小、不受天氣和氣候變化影響、能源利用效率高，還能促進一碳資源的清潔利用，減少碳排放。

基于豐富的一碳代謝途徑，目前已實現天然一碳利用微生物生產單細胞蛋白，但由于這類微生物存在一碳利用效率低、單細胞蛋白生產成本高的問題，因此利用合成生物學和基因工程手段改良微生物性狀，進一步強化底物利用效率，有望助力實現單細胞蛋白的工業化生產[71]。微藻和光合細菌通過CBB循環以CO2為碳源生產單細胞蛋白，利用基因工程方法優化其關鍵酶可提高CO2利用效率，進一步提高單細胞蛋白生產效率[9]。在釀酒酵母等傳統被認為可食用的菌種中構建異源一碳利用途徑生產單細胞蛋白也是一種新的研究方向[72-73]。釀酒酵母作為真核模式生物，具有安全無毒、易于生產、基因背景清晰，基因操作容易等優點。改造模式微生物利用一碳化合物生產單細胞蛋白，不僅可以拓展食品蛋白供給來源，還可以促進一碳資源的高效利用。

目前利用一碳化合物實現大規模生產單細胞蛋白的微生物種類主要包括細菌和微藻。這兩類微生物單細胞蛋白的蛋白質含量較高，但微藻細胞壁較厚，需要經過細胞破碎來提高單細胞蛋白的可消化性；而細菌蛋白的核酸（尤其是RNA）含量較高，需要增加核酸脫除工藝。與動物和植物蛋白生產相比，目前微生物利用一碳底物生產單細胞蛋白供人類食用成本較高，且相關培養工藝和生產技術仍不成熟。一些微生物單細胞蛋白如乙醇梭菌蛋白已用作飼料蛋白生產[41]，可通過升級生產工藝提高單細胞蛋白的安全性和可接受度，進而用于生產食品蛋白。此外，雖然微生物單細胞蛋白可用于生產高營養食品原料、可直接改善終產品的功能屬性，但目前受眾面較窄。未來在保持其營養價值的前提下，既要確保單細胞蛋白的安全性和功能性，更要注重產品的顏色、氣味、口味等感官特性為食用者所喜歡，從而提高產品在消費者中的可接受度，實現微生物單細胞蛋白食品的產業化發展。